Аффинно очищенные антитела: Стыдливое мракобесие: scinquisitor — LiveJournal

Содержание

Чем нас лечат: Ренгалин — Индикатор

В другом исследовании группой сравнения авторы не пренебрегли: в излечении кашля у детей с Ренгалином соревновались Амброксол и Синекод. Однако посреди статьи красуется реклама Ренгалина (за которую журналу явно заплатили), финансировал ее производитель, а ослепления в ней не сделали. А значит, проводя испытание, врачи знали, кому что достанется, и могли субъективно трактовать или специально подтасовать результат. Поэтому доверять ему не стоит, хотя по некоторым формальным показателям (p-value < 0,05) оно и выглядит прилично.

Статья в журнале «Антибиотики и химиотерапия» описывает испытание на 139 участниках. Ренгалин здесь сравнивается с Коделаком и признан сопоставимым по эффективности. Правда, проблемы с ослеплением никуда не уходят. Тем более, что в исследование включили пациентов с непродуктивным кашлем, который длился не менее 12 часов и не более семи дней! Таким образом, врачи могли попросту определить побольше уже долго кашляющих в группу Ренгалина и получить «волшебное» исцеление.

Четвертое исследование не сильно ушло вперед: в заключении статьи висит реклама Ренгалина. Несмотря на то что исследование на сей раз двойное слепое, надежд оно внушает мало. «За семь дней лечения выраженность дневного кашля уменьшилась до 1,0±0,9 баллов в группе Ренгалина и 1,2±0,9 баллов в группе плацебо; ночного до 0,1±0,4 баллов и 0,3±0,5 баллов в группах соответственно» — такие результаты успехом не назовешь. А если заглянуть в таблицы с этими баллами, то можно узнать, что у группы плацебо почему-то средние баллы меньше, особенно поначалу, а вот у принимавших Ренгалин огромные стандартные отклонения.

Indicator.Ru не рекомендует: перед вами обычная гомеопатия

Ренгалин — очередное детище компании «Материа Медика», порочащей название работы Карла Линнея. Для многих уже эта информация станет сигналом прекратить и читать, и выбирать такое средство для лечения. В таблетках и растворах этого препарата действующего вещества практически нет. При этом, если бы оно и было, от него могло бы стать хуже: лечить кашель, подавляя работу гистамина, брадикинина и морфина, — бессмысленная затея.

Несмотря на регистрацию и клинические испытания, препарат не доказал лекарственных свойств. Четыре статьи об этом лекарстве, вышедшие в низкорейтинговых российских изданиях, бодро перемежаются рекламой Ренгалина. Несмотря на все аргументы авторов и иногда (но не всегда) красивые цифры в статистике, становится понятно, почему приличные журналы не опубликовали их работ. Обвинять производителей мы не будем, пусть выводы сделает сам читатель (а может, и следственный комитет, как в Беларуси).

Наши рекомендации нельзя приравнивать к назначению врача. Перед тем, как начать принимать тот или иной препарат, обязательно посоветуйтесь со специалистом.

Понравился материал? Добавьте Indicator.Ru в «Мои источники» Яндекс.Новостей и читайте нас чаще.

Подписывайтесь на Indicator.Ru в соцсетях: Facebook, ВКонтакте, Twitter, Telegram, Одноклассники.

Аффинно очищенные антитела что это такое

Что такое анаферон. Аффинно очищенные антитела к человеческому интерферону гамма

Весна — пора простуд и вирусных инфекций. Но если вы пойдете в аптеку, то обнаружите, что на полке с противовирусными препаратами примерно половина содержимого — пустышки, не имеющие никакого отношения к лекарствам. Мошенники от фарминдустрии зарабатывают миллиарды на вашей доверчивости.

Ладно еще разработанные в перестроечное время российские препараты, не имеющие доказательств эффективности по международным нормам доказательной медицины, а только несколько отечественных работ (речь идёт о пресловутом арбидоле и, например, циклофероне), но на полках множество средств по определению не являющихся лекарствами или противовирусными препаратами, хотя бы просто потому, что в них нет действующих веществ, они пустышки. Речь идёт о гомеопатии типа анаферона, оциллококцинума, афлубина и эргоферона. И если по первым двум информации в интернете море (да достаточно заглянуть хотя бы в википедию: Оциллококцинум , Анаферон), то с эргофероном давайте разберемся подробнее. Можно почитать его инструкцию, это очень занимательное занятие.

Небольшое отступление. Речь идёт о гомеопатии, у которой много активных сторонников (хотя правильнее было бы сказать адептов, или верующих). Давайте расставим все точки над i:

Научное сообщество расценивает гомеопатию как мошенничество, ссылаясь на отсутствие научных основ этого метода лечения болезней. Теоретическое обоснование гомеопатического принципа не соответствует научным представлениям о функционировании здорового и больного организма, а осуществлённые клинические испытания гомеопатических препаратов не выявили различий между гомеопатическим лекарством и плацебо. Тривиальные вычисления показывают, что препараты в разведениях 12C и выше с большой вероятностью не содержат ни одной молекулы действующего вещества.

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) предостерегает от гомеопатического лечения инфекционных и любых других серьёзных заболеваний. Как отмечают эксперты организации, «использование гомеопатии не имеет до

Эргоферон — Википедия

Материал из Википедии — свободной энциклопедии

Эргоферон
Ergoferon
Действующее вещество
отсутствует
Классификация
Фармакол. группа гомеопатическое средство — не указано в инструкции;
противовирусное и иммуностимулирующее средство[1]
Лекарственные формы
раствор для приема внутрь;
таблетки для рассасывания
Другие названия
Эргоферон

Эргоферон — гомеопатическое средство. Разработан ООО НПФ «Материа Медика Холдинг» в 2011 году[2]. По заявлению производителя, оказывает противовирусный, противовоспалительный и антигистаминный эффект.

В инструкции препарата не указано, что Эргоферон относится к гомеопатическим средствам[3]. Несмотря на то что принцип потенцирования, который лежит в основе создания нескольких препаратов «Материа Медика», заимствован из гомеопатии, ни в инструкциях, ни на упаковках производитель не указывает, что это гомеопатическое средство.

Систематические обзоры показывают, что терапевтическое действие гомеопатических средств обусловлено эффектом плацебо[4][5]. Всемирная организация здравоохранения и FDA предостерегают от лечения инфекционных и других серьезных заболеваний гомеопатическими препаратами, так как возможно нанести реальную угрозу здоровью и жизни[6][7][8]. NHMRC официально заявил, что гомеопатия не несёт пользы здоровью и может навредить[9].

Состав

Согласно данным производителя:

  • антитела к гамма интерферону человека аффинно очищенные (0,006 г),
  • антитела к гистамину аффинно очищенные (0,006 г)
  • антитела к CD4 аффинно очищенные (0,006 г)

наносятся на лактозы моногидрат в виде смеси трех активных водно-спиртовых разведений субстанции, разведенной соответственно в 10012, 10030, 10050 раз[3].

Для Эргоферона, как и для всех гомеопатических препаратов со сверхнизким разведением активного компонента[10], не доказана ни эффективность, ни содержание в препарате заявленных компонентов.

Фармакологическое действие

По заявлению производителя, спектр фармакологической активности препарата «Эргоферон» включает в себя противовирусную, иммуномодулирующую, антигистаминную и противовоспалительную. Эргоферон позиционируется как средство от гриппа А и гриппа В, острых респираторных вирусных инфекций, герпесвирусных инфекций, острых кишечных инфекций вирусной этиологии, энтеровирусного и менингококкового менингита, геморрагической лихорадки с почечным синдромом, клещевого энцефалита. Также «Материа Медика» заявляет, что препарат эффективен при лечении и профилактике бактериальных инфекций и предупреждает развитие суперинфекций, увеличивает эффективность вакцинации[3].

Производитель заявляет, что

компоненты, входящие в препарат, обладают единым механизмом действия в виде повышения функциональной активности CD4 рецептора, рецепторов к интерферону гамма (ИФН-γ) и гистамину, соответственно; что сопровождается выраженным иммунотропным действием.

Однако терапевтическое действие препарата «Эргоферон» обусловлено эффектом плацебо, как и у всех гомеопатических препаратов[11]. Действующее вещество в представленных в препарате дозах не способно оказывать какое-либо действие на организм.

В инструкции к препарату производитель сообщает, что

чувствительность современных физико-химических методов анализа <…> не позволяет оценивать содержание сверхмалых доз антител в биологических жидкостях, органах и тканях, что делает технически невозможным изучение фармакокинетики препарата Эргоферон.

Примечания

  1. ↑ Государственный реестр лекарственных средств (рус.). Минздрав России (17 января 2017). Проверено 17 января 2017.
  2. ↑ Официальный сайт Материа Медика
  3. 1 2 3 Официальный сайт Эргоферона
  4. Shang A., Huwiler-Müntener K., Nartey L., Jüni P., Dörig S., Sterne JA., Pewsner D., Egger M. Are the clinical effects of homoeopathy placebo effects? Comparative study of placebo-controlled trials of homoeopathy and allopathy. // Lancet.. — 2005. — № 366. — С. 726—732.
  5. Cucherat M., Haugh MC., Gooch M., Boissel JP. Evidence of clinical efficacy of homeopathy. A meta-analysis of clinical trials. HMRAG. Homeopathic Medicines Research Advisory Group // Lancet. — 2000. — № 56. — С. 27-33.
  6. ↑ ВОЗ предостерегает от гомеопатического лечения
  7. ↑ ВОЗ высказалась против гомеопатии
  8. ↑ Homeopathy For Health
  9. ↑ Homeopathy not effective for treating any condition, Australian report finds | Life and style | The Guardian
  10. Ernst E. Systematic review of systematic reviews of homeopathy // British Journal of Clinical Pharmacology. — 2002. — № 6. — С. 577–82.
  11. ↑ Lancet 2005; 366: 726—732.

инструкция по применению — справочник лекарственных препаратов Medum.ru

Торговое наименование

Антитела к морфину аффинно очищенные

Фармакотерапевтическая группа

Фармакологическое действие

Гомеопатический препарат, улучшает функциональное состояние церебральных структур (миндалевидный комплекс, орбитофронтальная кора, гиппокамп), снижая выраженность стресс-абстинентного синдрома. Нормализует поведение, оказывает анксиолитический эффект, повышает порог болевой чувствительности.

Облегчает соматовегетативные (озноб, зевота, слезотечение, повышенное потоотделение и др.), неврологические (тремор, артралгия, миалгия), психопатологические (раздражительность, тревожность, эмоциональная напряжённость), симптомы опийного абстинентного синдрома. Способствует наступлению сна.

Способ применения и дозы

На один приём держать во рту до полного растворения 1 таблетку. В первые часы лечения приём осуществлять каждые 20 минут — до появления сна или сонливости. После пробуждения принимать по 1 таблетке через 40 минут.

При улучшении состояния (обычно с 4 дня терапии) достаточно принимать препарат 6–8 раз в день. Средний курс лечения — до 7 дней.

Может использоваться для монотерапии. При отсутствии значимого эффекта в течение 4–6 часов лечения продолжать принимать препарат совместно с ЛС, традиционно используемыми для лечения опийного абстинентного синдрома (что позволяет сократить объем необходимой терапии и сроки её применения).

Антитела к гистамину аффинно очищенные+Антитела к человеческому ФНО-α аффинно очищенные+Антитела к мозгоспецифическому белку S-100 аффинно очищенные инструкция по применению, цена, аналоги, показания, совместимость, отзывы

пл. Революции, д.5 (1)

пл. Советская, остановка общ.транспорта (1)

пр-кт Гагарина, д. 113 (1)

пр-кт Героев, д. 26 (1)

пр-кт Ленина, д. 2, пом. П11Б (1)

пр-кт Ленина, д. 67 (1)

пр-т. Бусыгина, д.19 (1)

пр-т. Бусыгина, д.45А (1)

пр-т. Гагарина, д.107 (1)

пр-т. Гагарина, д.184 (1)

пр-т. Гагарина, д.222 (1)

пр-т. Гагарина, д.4 (1)

пр-т. Гагарина, д.84 (1)

пр-т. Кораблестроителей, д.22 (1)

пр-т. Кораблестроителей, д.25 (1)

пр-т. Кораблестроителей, д.4 (1)

пр-т. Ленина, д.16 (1)

пр-т. Ленина, д.28А (1)

Перестаньте уже верить аптекарям. Очередная история про фуфломицины и гомеопатию

Покупал недавно активированный уголь, вместо обычной недорогой бумажной упаковки аптекарь торжественно подала мне на вытянутых руках коробку покрытую сусальным золотом, которая стоила как чугунный мост. Уголь там был получен из сгоревшего на горе Афон дерева и очищен слезами девственниц. ТРИЖДЫ! пришлось требовать обычный уголь. «Нет дешевого, да этот лучше, да он поможет сразу». Времена меняются, раньше продавцы фуфла по подъездам бегали, теперь в аптеках сидят.

И вот свежая история с Пикабу:

Подстыл вчера , зашёл в аптеку — «Сердце Брянска» по адресу ул. 3 Интернационала, д.4. Попросил упаковку «Колдрекса» или «Терафлю» и таблетки от сухого кашля. Не ожидая подвоха, расплатился, но решил сразу взглянуть на состав неизвестного мне ранее «препарата»(«Ренгалин»), а там…классика фуфломицинов:

1. Сахар(изомальт),
2. Антитела к брадикинину аффинно очищенные – 0,006 г*
3. Антитела к гистамину аффинно очищенные – 0,006 г*
4. Антитела к морфину аффинно очищенные – 0,006 г*
5. Прочая вспомогательная хрень.

Ну и разумеется, по поводу п.п.2-4 сноска со звёздочкой:
* наносятся на изомальт в виде смеси трех активных водно-спиртовых разведений субстанции, разведенной соответственно в 100^12, 100^30, 100^50 раз.

Т.е. примерно по 1-й молекуле «антитела» на 1-2 наших галактики.
(Кто не в курсе, никакие антитела не попадут к вам и не заработают в принципе путём потребления оных через рот и желудок).

Спросил ошалелую продаваншу(ввиду дальнейшего с ней общения никем иным назвать её язык не повернётся) — а зачем она мне вместо препарата от кашля продала эту пустышку? Попросил забрать обратно и продать всё же действующий препарат, а не тупо сахар.

После этого только через двадцать минут словесной перепалки, когда уже я начал бычить и крыть трёхэтажным, параллельно оставив жалобу, эта особь всё же сделала возврат(но на такой ноте, как в анекдоте про автосервис — «не прокатило»).

А до того, с наглой, как у моего кота рожей, всё доказывала мне, что:
— Этот препарат реально помогает;
— Это раньше он был гомеопатией, а теперь его Минздрав чота-там признал;
— Это у неё медицинское образование, ей виднее;
— А ты ж не просил конкретно, потому претензий быть не может;
— А сейчас вообще ЧОП вызову.

Я давненько не встречал такого уровня наглости и охуевания от одного отдельно взятого человека, я, честно, будучи взъярён ситуацией с и до того плохим настроением ввиду неважного самочувствия, уже слегка чесался кулаками — всё больше хотелось этой мадаме зубной дебет с кредитом свести. Никакие мои доводы, что сей «препарат» — фуфло, о чём явно написано на его коробке, к лекарственным это говно в принципе относится не может, не работали.

https://pikabu.ru/story/kak_tolkayut_fuflomitsin_v_aptekakh_bryanska_rengalin_6348475

Антитела к γ-интерферону человека аффинно очищенные+Антитела к гистамину аффинно очищенные+Антитела к CD4 аффинно очищенные инструкция по применению, цена, аналоги, показания, совместимость, отзывы

пер. Камчатский, д.1 (1)

пл. Комсомольская, д.6 (1)

пл. Революции, д.5 (1)

пл. Советская, остановка общ.транспорта (1)

пр-кт Гагарина, д. 113 (1)

пр-кт Героев, д. 26 (1)

пр-кт Ленина, д. 2, пом. П11Б (1)

пр-кт Ленина, д. 67 (1)

пр-т. Бусыгина, д.19 (1)

пр-т. Бусыгина, д.45А (1)

пр-т. Гагарина, д.107 (1)

пр-т. Гагарина, д.184 (1)

пр-т. Гагарина, д.222 (1)

пр-т. Гагарина, д.4 (1)

пр-т. Гагарина, д.84 (1)

пр-т. Кораблестроителей, д.22 (1)

пр-т. Кораблестроителей, д.25 (1)

пр-т. Кораблестроителей, д.4 (1)

Обзор Affinity Purification | Thermo Fisher Scientific

Для обогащения или очистки интересующего белка от других белков и компонентов в неочищенном клеточном лизате или другом образце используются различные методы. Самым мощным из этих методов является аффинная хроматография, также называемая аффинной очисткой, при которой представляющий интерес белок очищается благодаря его специфическим свойствам связывания с иммобилизованным лигандом.


Вступление

Белки и другие представляющие интерес макромолекулы могут быть очищены из сырых экстрактов или других сложных смесей различными методами. Селективное осаждение, пожалуй, самый простой метод отделения макромолекул одного типа от другого.

Однако большинство методов очистки включают в себя ту или иную форму хроматографии, при которой молекулы в растворе (подвижная фаза) разделяются на основе различий в химическом или физическом взаимодействии с неподвижным материалом (твердая фаза). Гель-фильтрация (также называемая эксклюзионной хроматографией или SEC) использует пористый полимерный материал для разделения молекул в зависимости от размера (то есть физического исключения). В ионообменной хроматографии молекулы разделяются в соответствии с силой их общего ионного взаимодействия с твердофазным материалом (т.е.е., неспецифические взаимодействия).

Напротив, аффинная хроматография (также называемая аффинной очисткой) использует специфические связывающие взаимодействия между молекулами. Конкретный лиганд химически иммобилизован или «связан» с твердой подложкой, так что когда сложная смесь проходит через колонку, молекулы, обладающие специфическим сродством связывания с лигандом, становятся связанными. После смывания других компонентов пробы связанная молекула отделяется от подложки, что приводит к ее очистке от исходного образца.

Каждая конкретная система сродства требует своего собственного набора условий и представляет свои особые проблемы для данной исследовательской цели. В статьях о других методах протеина описаны факторы и условия, связанные с конкретными системами очистки (см. Ссылки на боковой панели в конце этой страницы). Тем не менее, используемые общие принципы одинаковы для всех систем связывания лиганд-мишень, и эти концепции находятся в центре внимания данного обзора.


Справочник по приготовлению белков

Этот 32-страничный справочник предоставляет полезную информацию о нашем широком ассортименте реагентов и инструментов для экстракции, очистки, иммунопреципитации и очистки белков.Практическая информация, руководства по выбору и соответствующие данные включены, чтобы помочь вам улучшить выход белка и последующий анализ.

Были рассмотрены следующие конкретные темы:

  • Лизис и фракционирование клеток
  • Диализ белка и другие методы очистки
  • Иммунопреципитация и анализ методом pull-down
  • Другие способы приготовления белка

Загрузить Руководство по приготовлению белков

Download the Protein Preparation Handbook

Как работает аффинная очистка

Аффинная очистка обычно включает следующие стадии:

  1. Инкубируйте неочищенный образец (например,g., клеточный лизат или сыворотка) с аффинной подложкой, чтобы позволить целевой молекуле в образце связываться с иммобилизованным лигандом.
  2. Смыть несвязанные компоненты образца с подложки, используя соответствующие буферы, которые поддерживают связывающее взаимодействие между мишенью и лигандом.
  3. Элюировать (диссоциировать и восстанавливать) целевую молекулу из иммобилизованного лиганда, изменяя условия буфера, чтобы больше не происходило связывающее взаимодействие.

Маломасштабная аффинная очистка с использованием антитела, иммобилизованного на твердой подложке. Хроматография состоит из трех основных компонентов: подвижной фазы или растворителя, содержащего белки, неподвижной или твердой фазы, также называемой средой или смолой (которая может быть агарозой или другой пористой смолой) и хроматографической колонки. Аффинная хроматография очень селективна и обеспечивает высокое разрешение при средней и высокой нагрузочной способности образца. Интересующий белок прочно связывается со смолой в условиях, способствующих специфическому связыванию с лигандом, а несвязанные загрязнения смываются.Связанный белок затем выделяют в высокоочищенной форме путем изменения условий, способствующих элюированию. Условия элюирования могут быть специфическими, такими как конкурентный лиганд, или неспецифическими, такими как изменение pH, ионной силы или полярности. Целевой белок элюируется в очищенной и концентрированной форме.


За один проход образца сыворотки или клеточного лизата через аффинную колонку можно достичь более чем 1000-кратной очистки определенного белка, так что после гель-электрофореза будет обнаружена только одна полоса (например,g., SDS-PAGE) анализ.

Чаще всего лиганды иммобилизованы или «связаны» непосредственно с твердым материалом носителя путем образования ковалентных химических связей между конкретными функциональными группами лиганда (например, первичными аминами, сульфгидрилами, карбоновыми кислотами, альдегидами) и реактивными группами на носителе (см. соответствующая статья о ковалентной иммобилизации). Однако также возможны подходы с косвенной связью. Например, слитый белок, помеченный глутатион-S-трансферазой (GST), может сначала быть захвачен глутатионовой подложкой посредством аффинного взаимодействия глутатион-GST, а затем вторично химически сшит для его иммобилизации.Затем иммобилизованный слитый белок с GST-меткой можно использовать для аффинной очистки связывающего партнера (ов) слитого белка.

Лиганды, которые связываются с общими классами белков (например, антителами) или обычно используемыми тегами слитых белков (например, гистидиновой меткой или His-меткой), коммерчески доступны в предварительно иммобилизованных формах, готовых к использованию для аффинной очистки. Альтернативно, более специализированные лиганды, такие как специфические антитела или представляющие интерес антигены, могут быть иммобилизованы с использованием одного из нескольких коммерчески доступных активированных носителей сродства; например, пептидный антиген можно иммобилизовать на носителе и использовать для очистки антител, распознающих пептид.


Буферы связывания и элюции для аффинной очистки

В большинстве процедур аффинной очистки, включающих взаимодействия белок: лиганд, используются связывающие буферы с физиологическим pH и ионной силой, такие как фосфатно-солевой буферный раствор (PBS).Это особенно верно, когда взаимодействия антитело: антиген или нативный белок: белок являются основой для аффинной очистки. Как только происходит связывание, носитель промывают дополнительным буфером для удаления несвязавшихся компонентов образца. Неспецифические (например, простые ионные) взаимодействия связывания можно минимизировать, добавляя низкие уровни детергента или умеренно регулируя концентрацию соли в связывающем и / или промывочном буфере. Наконец, добавляется буфер для элюции, чтобы разорвать взаимодействие связывания и высвободить целевую молекулу, которая затем собирается в очищенной форме.

Буферы для элюирования диссоциируют партнеров по связыванию за счет крайних значений pH (низкий или высокий), высокой соли (ионной силы), использования детергентов или хаотропных агентов, денатурирующих одну или обе молекулы, удаления фактора связывания или конкуренции с противолигандом . В большинстве случаев требуется последующий диализ или обессоливание, чтобы заменить очищенный белок из буфера для элюции на более подходящий буфер для хранения или последующего анализа.

Наиболее широко используемый буфер для элюции для аффинной очистки на основе взаимодействия белков равен 0.1 М глицин • HCl, pH 2,5-3,0. Этот буфер эффективно диссоциирует большинство взаимодействий связывания белок: белок и антитело: антиген, не оказывая постоянного воздействия на структуру белка. Однако некоторые антитела и белки повреждаются из-за низкого pH, поэтому элюированные белковые фракции лучше всего немедленно нейтрализовать добавлением 1/10 объема щелочного буфера, такого как 1 M Tris • HCl, pH 8,5. Другие буферы для элюирования для аффинной очистки белков перечислены в таблице ниже.

Узнать больше
  • Технический совет № 27: Оптимизация условий элюирования для аффинной очистки

Стандартные буферные системы для элюирования для аффинной очистки белка

Эти условия относятся в первую очередь к взаимодействиям связывания белок-белок, например, между антителом и его пептидным антигеном.Буферы элюирования для связывающих взаимодействий между другими типами молекул могут быть совершенно разными.

Состояние Буфер
pH 100 мМ глицин • HCl, pH 2,5–3,0
100 мМ лимонная кислота, pH 3,0
50–100 мМ триэтиламин или триэтаноламин, pH 11,5
150 мМ гидроксид аммония, pH 10.5
Ионная сила
и / или
Хаотропные эффекты
3,5–4,0 М хлорид магния, pH 7,0 в 10 мМ Трис
5 М хлорид лития в 10 мМ фосфатном буфере, pH 7,2
2,5 М иодид натрия, pH 7,5
0,2-3,0 М тиоцианат натрия
денатурация 2–6 M гуанидин • HCl
2–8 M мочевина
1% дезоксихолат
1% SDS
Органическое 10% диоксан
50% этиленгликоль, pH 8-11.5 (также хаотропный)
Конкретный конкурент > 0,1 М контрлиганд или аналог
(например, с использованием глутатиона для элюирования GST-меченных белков из иммобилизованной глутатион-агарозной смолы)
Узнать больше
  • Технический совет № 29: Дегазированные растворы для использования в колонках аффинной и гель-фильтрации

Твердые опоры для аффинной очистки

Аффинная очистка включает разделение молекул в растворе (подвижная фаза) на основе различий во взаимодействии связывания с лигандом, иммобилизованным на неподвижном материале (твердая фаза).Носитель или матрица при аффинной очистке представляет собой любой материал, к которому ковалентно присоединен биоспецифический лиганд. Обычно материал, который будет использоваться в качестве аффинной матрицы, нерастворим в системе, в которой находится целевая молекула. Обычно, но не всегда, нерастворимая матрица является твердой. Сотни веществ были описаны и использованы в качестве аффинных матриц, включая агарозу, целлюлозу, декстран, полиакриламид, латекс и стекло с контролируемыми порами. Подходящими аффинными носителями являются носители с высоким отношением площади поверхности к объему, химическими группами, которые легко модифицируются для ковалентного присоединения лигандов, минимальными неспецифическими связывающими свойствами, хорошими характеристиками текучести и механической и химической стабильностью.


Пористые гелевые опоры

Пористые подложки (также называемые смолами или гелями) обычно обеспечивают наиболее полезные свойства для аффинной очистки белков. Эти типы носителей обычно представляют собой полимерные смолы на основе сахара или акриламида, которые производятся в растворах (т.е.е., гидратированный) в виде шариков диаметром 50-150 мкм. Формат в виде шариков позволяет поставлять эти смолы в виде влажных суспензий, которые можно легко дозировать для заполнения и «упаковки» колонн со слоями смолы любого размера. Гранулы чрезвычайно пористые и достаточно большие, чтобы биомолекулы (белки и т. Д.) Могли свободно течь внутрь и через гранулы, а также между и вокруг поверхности гранул. Лиганды ковалентно прикрепляются к полимеру гранул (внешняя и внутренняя поверхности) различными способами. В результате получается рыхлая матрица, в которой молекулы образца могут свободно проходить через иммобилизованный лиганд с большой площадью поверхности.

Безусловно, наиболее широко используемой матрицей для методик аффинной очистки белка является сшитая агароза в виде гранул, которая обычно доступна с плотностями 4% и 6%. (Это означает, что слой смолы на 1 мл состоит из более чем 90% воды по объему.) Агароза в гранулах хороша для повседневных применений, поскольку она легко измельчается, что делает ее пригодной для гравитационного потока, центрифугирования с низкой скоростью и низкого давления. процедуры. Дополнительное сшивание и / или химическое отверждение гранулированной агарозной смолы может повысить ее способность выдерживать более высокие давления, но также может привести к снижению связывающей способности.

Смолы на основе полиакриламида также используются в качестве носителей для колоночной аффинной хроматографии. Одним из примеров является Thermo Scientific UltraLink Biosupport, который не сжимается так же легко, как обычная агароза в гранулах. UltraLink Biosupport может использоваться в системах среднего давления с перистальтическим насосом или другими системами жидкостной хроматографии. И агароза, и носители UltraLink обладают низкими характеристиками неспецифического связывания; тем не менее, в отдельных приложениях они ведут себя несколько иначе.


Физические свойства смол для аффинной хроматографии

Сшитая 4% агароза с гранулами и сшитая 6% агароза с гранулами обычно обозначаются сокращенно как агароза CL-4B и агароза CL-6B соответственно.Также см. Таблицу ниже о выборе опор в зависимости от масштаба использования.

Сшитая 4%
агароза в гранулах
Сшитая 6%
агароза в гранулах
Агароза Superflow (сильно сшитая) UltraLink Biosupport
(акриламидно-азлактоновый полимер)
Размер борта
диапазон
от 45 до 165 мкм от 45 до 165 мкм от 45 до 165 мкм от 50 до 80 мкм
Исключение
предел
20000 кДа 4000 кДа 6000 кДа 2000 кДа
Давление
предел
0.35 МПа 0,35 МПа 0,65 МПа

0,69 МПа

Методы гравитационное или низкоскоростное центрифугирование гравитационное или низкоскоростное центрифугирование FPLC системы,
самотечные
Системы FPLC, ВЭЖХ, самотечный
Муфта
усилие
средний средний средний

высокий

Диапазон pH
(допуск)
3–11 3–11 2–12 1–13

Магнитные частицы

Магнитные частицы — это совершенно другой тип аффинной подложки, чем гранулированная агароза и другие пористые смолы.Они намного меньше (обычно в диаметре 1–4 мкм) и твердые (непористые). Их небольшой размер обеспечивает достаточное соотношение площади поверхности к объему, необходимое для эффективной иммобилизации лиганда и аффинной очистки. Магнитные шарики производятся в виде частиц суперпарамагнитного оксида железа, ковалентно покрытых производными силана. Покрытие делает шарики инертными (чтобы минимизировать неспецифическое связывание) и обеспечивает определенные химические группы, необходимые для присоединения интересующих лигандов.

Аффинная очистка магнитными частицами не выполняется в колонке.Вместо этого несколько микролитров гранул смешивают с несколькими сотнями микролитров образца в виде рыхлой суспензии. Во время перемешивания шарики остаются суспендированными в растворе образца, позволяя происходить аффинным взаимодействиям с иммобилизованным лигандом. По прошествии достаточного времени для связывания шарики собирают и отделяют от образца с помощью мощного магнита. Обычно простые настольные процедуры выполняются в микроцентрифужных пробирках, а для удаления образца (или промывочных растворов и т. Д.) Используется пипетирование или декантирование.), а магнитные шарики удерживаются на месте на дне или сбоку трубки с помощью подходящего магнита.

Преимущества магнитных частиц перед пористыми смолами:

  • Магнитные шарики обладают меньшим неспецифическим связыванием, чем пористые носители.
  • Магнитные шарики могут использоваться для процедур разделения клеток.
  • Магнитные шарики подходят для высокопроизводительной автоматизации.

Магнитные шарики обычно заменили смолу агарозы в качестве предпочтительного носителя для методик очистки в масштабе анализа, таких как иммунопреципитация (IP) и вытеснение.Кроме того, для проведения анализов и процедур очистки с использованием магнитной сепарации доступны все более сложные и мощные инструменты для работы с пробами.


Приложения и масштабы использования

Предполагаемый масштаб очистки и последующее применение, возможно, являются наиболее важными соображениями при выборе типа поддержки аффинности.Различия в пределах давления (см. Таблицу выше), максимальные скорости потока и такие факторы, как стоимость (например, магнитные частицы будут слишком дорогими для использования в больших масштабах), определяют, какая опора подходит для использования в данной хроматографической системе.

Соответствующие приложения и масштабы использования поддерживает аффинную хроматографию.

Скрининг или анализ
Шкала
Партия
Весы
Pilot
Масштаб
Процесс
Масштаб
Урожай Микрограмм (мкг) Миллиграмм (мг) Миллиграмм в грамм граммы в килограммы
Техника Автоматический процессор частиц;
96-луночные вращающиеся планшеты
Гравитационный поток;
Спиновые колонки
FPLC при низких и средних расходах FPLC при высоких расходах
Приложения Грохочение с высокой пропускной способностью;
интракционных исследования;
мутационный анализ;
Вестерн-блот
Функциональные анализы; Структурный анализ Структурный анализ; Производственная шкала Серийное производство
Подходящие опоры

Типы аффинной очистки

Различные классы аффинных мишеней, а также разные цели очистки требуют рассмотрения разных приоритетов (например,g., высокая чистота по сравнению с высоким выходом), технические ограничения и буферные условия для разработки успешной процедуры. В следующих разделах описаны некоторые из наиболее распространенных систем аффинной очистки. Ссылки на более подробные статьи о конкретных методах очистки приведены в серых прямоугольниках.


Очистка антител

Некоторые методы очистки антител включают методы аффинной очистки.Типичное производство антител в лабораторных условиях включает относительно небольшие объемы сыворотки, асцитной жидкости или супернатанта культуры. В зависимости от того, как антитело будет использоваться для различных методов анализа и обнаружения, оно должно быть частично или полностью очищено. Три уровня специфичности очистки включают следующие подходы:

  • Осаждение сульфатом аммония. Этот простой метод обеспечивает грубую очистку общего иммуноглобулина от других белков сыворотки.
  • Аффинная очистка с иммобилизованным белком A, G, A / G или L. Эти белки связываются с большинством видов и подклассов IgG, наиболее распространенного типа иммуноглобулина, продуцируемого млекопитающими в ответ на иммуногены. Готовые к использованию смолы и наборы для очистки с этими белками доступны во многих размерах и форматах упаковки.
  • Аффинная очистка с иммобилизованным антигеном. Ковалентная иммобилизация очищенного антигена (т.е. пептида или гаптена, используемых в качестве иммуногена для индукции продукции антитела животным-хозяином) на аффинной подложке позволяет очистить специфическое антитело из неочищенных образцов.Доступны активированные смолы и полные наборы для приготовления иммобилизованных антигенов с помощью различных химических процессов.

Очистка антигена с помощью антител

Специфические антитела наиболее часто используются для обнаружения представляющих интерес антигенов в анализах, но они также могут использоваться для очистки антигенов.Поскольку производство или коммерческое использование специфических антител является дорогостоящим, этот подход редко используется для крупномасштабной очистки антигена. Вместо этого его использование почти полностью ограничено очень мелкими масштабами, что наиболее важно для анализов иммунопреципитации (см. Следующий раздел).

Тем не менее, когда очищенное антитело доступно, его можно ковалентно иммобилизовать на гранулированной агарозе или другом носителе сродства с помощью любого из нескольких эффективных способов конъюгации. Ковалентная иммобилизация с помощью первичных аминов, как и в наборах для связывания AminoLink Plus от Thermo Scientific, является особенно простым и эффективным методом приготовления аффинной колонки с антителами.


Иммунопреципитация и коиммунопреципитация

Иммунопреципитация (IP) относится к мелкомасштабной аффинной очистке антигена с использованием специфического антитела. Традиционная иммунопреципитация включает захват комплекса антитело-антиген иммобилизованной белковой A или G агарозной смолой (белок A или G связывает антитело, которое связано с его антигеном), а затем выделение очищенного антигена в буфере для загрузки образца для гель-электрофореза.

Коиммунопреципитация (Co-IP) включает попытку захвата и детектирования не только прямого антигена, но и любых белков в клеточном лизате, которые взаимодействуют (т. Е. Связываются с) антигеном. В традиционном формате с протеином A или протеином G эта схема очистки включает не менее трех уровней аффинного взаимодействия.

Путем адаптации и оптимизации других методов иммобилизации антител для небольших масштабов, необходимых для IP и Co-IP, было разработано несколько инноваций, которые преодолевают многие ограничения и сложности, связанные с традиционными методами IP.

.

методов очистки антител | Thermo Fisher Scientific

Производство и использование специфических антител в качестве зондов для обнаружения и лигандов очистки — часто называемых иммунодетекцией или иммунотехнологиями — произвело революцию в технологиях биологических исследований и диагностики. Животные, иммунизированные подготовленными антигенами, будут продуцировать специфические антитела против антигена. После очистки (и, возможно, после мечения их ферментом или флуоресцентной меткой) эти антитела можно использовать непосредственно для зондирования специфического антигена с помощью вестерн-блоттинга, ELISA и других приложений.

Антисыворотка от иммунизированного животного может использоваться непосредственно для определенных применений, но чаще требуется некоторая форма очистки антител для получения зонда антитела, который эффективен для нескольких типов методов обнаружения. В этой статье кратко излагаются основные подходы и инструменты, доступные для очистки антител.


Вступление

Очистка антител включает селективное обогащение или специфическое выделение антител из сыворотки (поликлональные антитела), асцитной жидкости или супернатанта клеточной культуры линии гибридомных клеток (моноклональные антитела).Методы очистки варьируются от очень грубых до высокоспецифичных и могут быть классифицированы следующим образом:

  • Физико-химическое фракционирование — дифференцированное осаждение, исключение по размеру или твердофазное связывание иммуноглобулинов на основе размера, заряда или других общих химических характеристик антител в типичных образцах. Это изолирует подмножество образцов белков, которое включает иммуноглобулины.
  • Аффинность, специфичная для класса — твердофазное связывание определенных классов антител (например,g., IgG) иммобилизованными биологическими лигандами (белками, лектинами и т. д.), имеющими специфическое сродство к иммуноглобулинам. Это очищает все антитела целевого класса безотносительно к антигенной специфичности.
  • Антиген-специфическая аффинность — аффинная очистка только тех антител в образце, которые связываются с определенной молекулой антигена через свои специфические антигенсвязывающие домены. Это очищает все антитела, которые связывают антиген, независимо от класса или изотипа антител.

Антитела, которые были разработаны как линии клеток гибридомы с моноклональными антителами и продуцированы в виде асцитной жидкости или супернатанта клеточной культуры, могут быть полностью очищены без использования метода антиген-специфической аффинности (третий тип), поскольку целевое антитело (для большинства практических целей) является единственным иммуноглобулином. в производственном образце. Напротив, для поликлональных антител (образцы сыворотки) требуется антиген-специфическая аффинная очистка для предотвращения совместной очистки неспецифических иммуноглобулинов.Например, обычно только 2–5% общего IgG в сыворотке мышей специфичны для антигена, используемого для иммунизации животного. Тип (ы) и степень очистки, которые необходимы для получения пригодного для использования антитела, зависят от предполагаемого применения (й) антитела.

Antibody production and purification guide

Руководство по производству и очистке антител

Обновленное Техническое руководство по производству и очистке антител является важным ресурсом для любой лаборатории, работающей с антителами.В справочнике представлен обзор структуры и типов антител, а также техническая информация о процедурах, реагентах и ​​инструментах, используемых для получения, очистки, фрагментации и маркировки антител.

Техническое руководство по производству и очистке антител


Очистка антител физико-химическим фракционированием

Основные классы сывороточных иммуноглобулинов (например,g., IgG, IgM) имеют одинаковую общую структуру, включая общий аминокислотный состав и характеристики растворимости. Эти общие свойства в значительной степени отличаются от большинства других широко распространенных белков в сыворотке, таких как альбумин и трансферрин, поэтому иммуноглобулины могут быть выбраны и обогащены на основе этих дифференцирующих физико-химических свойств.

Эксклюзионная хроматография

Диализ, обессоливание и диафильтрация могут использоваться для обмена антител в определенные буферы и удаления нежелательных низкомолекулярных (MW) компонентов.Для отделения иммуноглобулинов (> 140 кДа) от небольших белков и пептидов можно использовать диализные мембраны, смолы для исключения размеров и устройства для диафильтрации с отсечкой по высокомолекулярному весу (MWCO). Однако, за исключением специальных колонок и оборудования, одни только эти методы не могут очистить антитела от других белков и макромолекул, которые присутствуют в типичных образцах антител. Чаще всего после других стадий очистки, таких как осаждение сульфатом аммония (1), используются гель-фильтрация и диализ.

Осаждение сульфатом аммония

Осаждение сульфатом аммония часто используется для обогащения и концентрирования антител из сыворотки, асцитной жидкости или супернатанта клеточной культуры. По мере увеличения концентрации этой лиотропной соли в образце белки и другие макромолекулы становятся все менее растворимыми до тех пор, пока они не выпадут в осадок; лиотропный эффект называется «высаливанием».«Антитела осаждаются при более низких концентрациях сульфата аммония, чем большинство других белков и компонентов сыворотки.

При 40-50% насыщении сульфатом аммония (100% насыщение равно 4,32 М) иммуноглобулины выпадают в осадок, в то время как другие белки остаются в растворе (2). Обычный метод заключается в очень медленном добавлении равного объема насыщенного раствора сульфата аммония к нейтрализованному антителу. образец с последующей инкубацией в течение нескольких часов при комнатной температуре или 4 ° C. После центрифугирования и удаления супернатанта осадок антител растворяют в буфере, таком как фосфатно-солевой буферный раствор (PBS).

Селективность, выход, чистота и воспроизводимость осаждения зависит от нескольких факторов, включая время, температуру, pH и скорость добавления соли (3). Осаждение сульфатом аммония обеспечивает достаточную очистку для некоторых применений антител, но чаще всего его проводят в качестве предварительного этапа перед колоночной хроматографией или другим методом очистки (например, набором для очистки моноклональных IgG из дынного геля). Использование частично очищенных образцов антител может улучшить производительность и продлить срок службы аффинных колонок.

Другие реагенты для осаждения антител, которые использовались для особых случаев очистки антител, включают использование октоновой кислоты, полиэтиленгликоля и этакридина (3).

Ионообменная хроматография

Многочисленные методы твердофазной хроматографии на химической основе были адаптированы и оптимизированы для достижения очистки антител в конкретных ситуациях.

Ионообменная хроматография (IEC) использует положительно или отрицательно заряженные смолы для связывания белков в зависимости от их суммарного заряда в данной буферной системе (pH). В частности, в коммерческих операциях, связанных с получением моноклональных антител, могут быть определены условия для IEC, которые связывают и высвобождают целевое антитело с высокой степенью специфичности. И наоборот, можно найти условия, при которых связываются почти все другие компоненты образца, кроме антител. После такой оптимизации IEC становится экономичным, щадящим и надежным методом очистки антител.

Хроматография с иммобилизованным хелатом металлов

Хроматография с иммобилизованным хелатом металлов (IMAC) использует хелатно-иммобилизованные ионы двухвалентных металлов (обычно никель, Ni2 +) для связывания белков или пептидов, содержащих кластеры из трех или более последовательных остатков гистидина.Эта стратегия чаще всего используется для очистки рекомбинантных белков, которые были сконструированы так, чтобы содержать концевую метку слияния 6xHis. Интересно, что IgG млекопитающих являются одним из немногих широко распространенных белков в сыворотке (или супернатанте культуры моноклональных гибридомных клеток), которые обладают кластерами гистидина, способными связываться с иммобилизованным никелем. Как и в случае с IEC, условия связывания и элюции IMAC можно оптимизировать для конкретных образцов, чтобы обеспечить бережную и надежную очистку антител (3). Например, набор для очистки конъюгата Pierce использует этот метод для отделения антитела, меченного АР или HRP (ферментно-конъюгированного), от избыточного неконъюгированного фермента после процедуры мечения.

Тиофильная адсорбция

Тиофильная адсорбция — это высокоселективный тип взаимодействия белок-лиганд, сочетающий в себе свойства хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) и осаждения сульфатом аммония (лиотропный эффект).Взаимодействие называется тиофильным, потому что оно включает связывание белков с сульфоновой группой в непосредственной близости от тиоэфира. В отличие от строгой HIC, тиофильная адсорбция зависит от высокой концентрации лиотропной соли (например, сульфата калия в отличие от хлорида натрия). С типичными образцами антител, уравновешенными сульфатом калия, связывание достаточно специфично для антител. После смывания несвязанных компонентов антитела легко извлекаются при щадящих условиях элюирования (например,g., 50 мМ натрий-фосфатный буфер, pH от 7 до 8). Тиофильный адсорбент (также называемый Т-гелем) представляет собой 6% гранулированную агарозу, модифицированную для содержания сульфон-тиоэфирного лиганда. Адсорбент обладает высокой связывающей способностью и широкой специфичностью по отношению к имуноглобулинам различных видов животных. Примечательно, что это один из немногих аффинных методов, эффективных для очистки куриного IgY.

Дынная гель-хроматография

Melon Gel — это запатентованный химический состав смолы (и оптимизированная буферная система) для очистки антител путем химического фракционирования.В указанных мягких буферных условиях смола Melon Gel связывает большинство белков, не являющихся IgG, обнаруженных в сыворотке, асцитной жидкости и культуральных супернатантах, позволяя собирать очищенный IgG в проточной фракции.

Различные наборы геля дыни оптимизированы для быстрой, удобной и бережной очистки IgG. Набор Melon Gel для очистки моноклональных антител демонстрирует преимущества сочетания двух методов очистки. Осаждение сульфатом аммония рекомендуется для образцов супернатанта клеточных культур перед проведением окончательной очистки геля дыни.Перед очисткой дынного геля рекомендуется обработка образцов асцитной жидкости кондиционирующим реагентом, чтобы уменьшить совместную очистку трансферрина с антителом.

Поскольку система Melon Gel использует отрицательный отбор и не требует этапов элюирования, она также обеспечивает удобный и эффективный метод удаления бычьего сывороточного альбумина (BSA) или желатина из исходных растворов антител, чтобы эти стабилизирующие белки не мешали процедурам маркировки антител. Это основа нашего набора Antibody Clean-Up Kit.

Если конкретное удаление одного конкретного нежелательного компонента сыворотки можно рассматривать как форму очистки антител, то здесь уместно упомянуть об удалении альбумина. На альбумин приходится ок. 60% сывороточного белка человека. Cibacron * Blue Dye селективно связывается с сывороточным альбумином человека и может использоваться в качестве аффинного лиганда для подготовки образцов сыворотки, не содержащих альбумина, для 2D-электрофоретического анализа.


Класс-специфическая аффинная очистка антител

Поскольку антитела имеют эволюционно консервативную общую структуру, включая относительно инвариантные домены, а их нативная функция включает связывание и защиту от патогенов, неудивительно, что некоторые патогенные бактерии развили белки, обладающие специфическими функциями связывания антител.Некоторые из этих связывающих иммуноглобулин белков были идентифицированы и изолированы от определенных видов бактерий. Точно так же, как нативные функции антител можно использовать в качестве зондов, специфичных для мишени, для исследования белков, эти нативные анти-Ig белки также можно использовать в качестве аффинных лигандов для очистки антител.

Белки A, G и L-связывающие антитела лиганды

Protein A, Protein G и Protein L — это три бактериальных белка, свойства связывания антител которых хорошо изучены.Эти белки были получены рекомбинантно и обычно использовались для аффинной очистки ключевых типов антител от различных видов. В большинстве коммерчески доступных рекомбинантных форм этих белков удалены ненужные последовательности (включая HSA-связывающий домен из белка G), и поэтому они меньше, чем их нативные аналоги. Генно-инженерная рекомбинантная форма протеина A и протеина G, называемая протеином A / G, также широко доступна. Все четыре рекомбинантных Ig-связывающих белка обычно используются исследователями в многочисленных иммунодетекциях и иммуноаффинных приложениях.

Источники и свойства нативных Ig-связывающих белков. Информация в этой таблице получена из различных источников. См. Соответствующие страницы «Узнать больше», где приведены ссылки и подробные сведения о рекомбинантных формах, используемых для иммуноаффинных приложений.
Белок A (SpA) Протеин G (SpG) Протеин L (SpL)
Виды Стафилококк
aureus
Streptococcus spp.
(группы C и G)
Peptostreptococcus magnus
Человек
Патология
Компонент флоры организма человека; причина заражения стафилококком Orig. изолировано от больных фарингитом (миндалины или кровь) Комменсальные и / или патогенные анаэробные грамположительные бактерии
Собственный
Размер (а)
от 40 до 60 кДа
(переменное количество повторяющихся доменов)
от 40 до 65 кДа
(переменное количество повторяющихся доменов)
76 кДа
Связывающие домены 5 для IgG (наиболее распространенная форма) 1-2 для IgG
0 до 2 для HSA
5 для Ig
Ig-связывающая мишень константная область тяжелой цепи (Fc) IgG (область Ch3-Ch4) констант тяжелой цепи.область (Fc) IgG (область Ch3-Ch4) каппа легких цепей Igs (VL-каппа)

Binding sites of antibody-binding proteins

Сайты связывания антител-связывающих белков. Белки, используемые для иммобилизации антител на подложке из гранул, проявляют специфичность к различным доменам антител.Белки A и G связываются с тяжелыми цепями области Fc антитела, в то время как белок L специфически связывает легкие цепи двух областей Fab фрагмента антитела F (ab ‘) 2. † Белок G также может связывать Fab-фрагменты в определенных условиях.

Очистка антител с белками A, G и L

Для очистки антител с помощью протеина A, протеина G, протеина A / G или протеина L их ковалентно иммобилизуют на пористых смолах (таких как агароза в виде шариков) или магнитных шариках.Поскольку эти белки содержат несколько доменов связывания антител, почти каждая отдельная иммобилизованная молекула, независимо от ее ориентации, поддерживает по крайней мере один функциональный и беспрепятственный домен связывания. Кроме того, поскольку белки связываются с антителами на сайтах, отличных от антигенсвязывающего домена, иммобилизованные формы этих белков можно использовать в схемах очистки, таких как иммунопреципитация, в которых связывающий антитело белок используется для очистки антигена из образца путем связывание антитела, когда оно связано со своим антигеном.

Белки A, G, A / G и L обладают разными связывающими свойствами, что делает каждый из них подходящим для разных типов мишеней антител (например, подкласса антител или видов животных). Важно понимать, что использование протеина A, G или L приводит к очистке общего иммуноглобулина из неочищенного образца. В зависимости от источника образца антиген-специфические антитела могут составлять лишь небольшую часть общего иммуноглобулина в образце. Например, обычно только 2–5% общего IgG в сыворотке мышей специфичны для антигена, используемого для иммунизации животного.

Используя в качестве примера колонку с агарозной смолой с протеином А и кроличьей сывороткой, общая процедура очистки антител с помощью этих лигандов следующая:

  1. Связывание: Добавьте в колонку осветленный, физиологически забуференный (pH 7-8) образец кроличьей сыворотки и дайте ему медленно пройти или смешайте со смолой с протеином A, чтобы позволить IgG связываться с иммобилизованным лигандом. .
  2. Промывка: Добавьте фосфатно-солевой буфер (PBS) и дайте ему пройти через колонку, чтобы смыть несвязанные компоненты сыворотки.Используйте объем промывочного буфера, в 5-10 раз превышающий объем смолы.
  3. Элюирование: Добавьте кислотный буфер для элюирования (например, 0,1 М глицин-HCl, pH 2,8) и соберите небольшие фракции раствора, которые проходят из колонки. В условиях низкого pH происходит диссоциация антитела от иммобилизованного белка А, и IgG выделяется в очищенном состоянии в одной или нескольких собранных фракциях.
  4. Нейтрализуйте или замените буфер: Используйте анализ белка или другие средства для идентификации и объединения фракций элюирования, содержащих очищенное антитело.Затем добавьте 1/10 объема 1M трис-HCl (pH 8,5), чтобы нейтрализовать буфер. В качестве альтернативы можно использовать колонку для обессоливания или диализ, чтобы заменить очищенное антитело на более подходящий буфер для длительного хранения.

Очистка IgM

Белок A и белок G связывают IgM очень плохо или совсем не связывают, отчасти потому, что сайты связывания на Fc-областях IgM стерически затруднены его пентамерной структурой.Для IgM (антитела класса M), которые обладают легкими цепями соответствующего типа (VL-каппа), для очистки можно использовать белок L; однако IgG, имеющие один и тот же тип легких цепей, будут очищаться совместно.

Для операций в промышленном масштабе антитела IgM обычно очищают с помощью комбинации методов, включая осаждение сульфатом аммония с последующей гель-фильтрацией, ионообменной хроматографией или зонным электрофорезом. Для образцов сыворотки (поликлональных) простой стратегией обогащения является осаждение сульфатом аммония с последующим удалением IgG с помощью протеина A или G.

Nethery, et al. (4) разработали метод аффинной очистки IgM с использованием C1q, компонента комплемента 439 кДа, который распознает углеводы на поверхности клеток. Невенс и др. (5) расширили и улучшили этот подход, используя в качестве лиганда аналогично структурированный белок активации комплемента, называемый маннан-связывающим белком (MBP). Наш набор для очистки IgM использует иммобилизованный MBP и является наиболее эффективным для очистки мышиного IgM от асцита. Очищенный IgM можно получить за один проход через аффинную колонку.Человеческий IgM будет связываться с носителем, хотя и с несколько меньшей емкостью, и давать продукт с чистотой не менее 88% по оценке ВЭЖХ. Очистка IgM от других видов и сыворотки мышей еще не оптимизирована.

Очистка IgA

Jacalin представляет собой лектин, связывающий a-D-галактозу, экстрагированный из семян джекфрута (Artocarpus integrifolia).Лектин представляет собой гликопротеин приблизительно 40 кДа, состоящий из четырех идентичных субъединиц. Жакалин, иммобилизованный на подложках, таких как агароза, был полезен для очистки человеческой сыворотки или секреторного IgA1. Аффинный лиганд позволяет очищать или удалять IgA из более распространенных IgG и IgM в сыворотке или молозиве человека (6). Сообщается, что IgD связывается с джакалином (7).

Очищение куриного IgY

Цыплята производят уникальную молекулу иммуноглобулина под названием IgY.Есть несколько преимуществ производства и использования IgY по сравнению с иммуноглобулинами млекопитающих. Что касается производства, выращивание и иммунизация цыплят относительно просты, цыплята с большей вероятностью будут вызывать иммунный ответ на консервативные белковые антигены млекопитающих, а цыплята вырабатывают в 15-20 раз больше антител, чем кролики.

Самое главное, что IgY естественно упакован в яичных желтках в высоких концентрациях, что делает повторный сбор антител у иммунизированных кур неинвазивным. Один яичный желток иммунизированной курицы содержит примерно 300 мг IgY.Целые яйца или отделенные яичные желтки можно собрать и хранить в замороженном виде для последующего извлечения антител.

Белок A, белок G и другие Fc-связывающие белки не связывают IgY. Тиофильный адсорбент (см. Выше) эффективен для очистки IgY от сыворотки и других жидкостей. Однако эффективная процедура с применением тиофильного адсорбента не разработана для использования с яичным желтком, который имеет очень высокие концентрации липидов. Вместо этого наш набор для очистки куриного IgY обеспечивает эффективную очистку IgY из яичных желтков за счет использования варианта осаждения сульфатом аммония после первого делипидирования образца яичного желтка с помощью запатентованного раствора.


Антиген-специфическая аффинная очистка антител

Хотя белки A, G, A / G и L являются отличными лигандами для очистки общего IgG из образца, часто требуется очистка антиген-специфических антител.Это может быть достигнуто путем иммобилизации конкретного антигена, используемого для иммунизации, так что только те антитела, которые специфически связываются с антигеном, очищаются в этой процедуре. Активированные аффинные носители, которые можно использовать для иммобилизации пептидов или других антигенов для использования в аффинной очистке, описаны в другой статье под названием «Методы иммобилизации лигандов для аффинной очистки» (ссылка скоро появится). В настоящей статье обобщаются конкретные проблемы, связанные с иммобилизацией антигена для использования при очистке антител.

Иммобилизация и презентация антигена

Успешная аффинная очистка антитела зависит от эффективного представления соответствующих эпитопов антигена на сайтах связывания антитела. Если антиген небольшой и иммобилизован непосредственно на твердой поверхности подложки множественными химическими связями, важные эпитопы могут быть заблокированы или стерически затруднены, что препятствует эффективному связыванию антител.Следовательно, лучше всего иммобилизовать пептидные антигены с использованием уникальной функциональной группы (например, сульфгидрила на одном концевом цистеине в пептиде) и использовать активированный носитель, реактивные группы которого находятся на спейсерных ветвях длиной в несколько атомов. Для больших (например, белковых) антигенов, особенно с несколькими сайтами иммобилизации, длина спейсерного плеча становится менее важной, поскольку сам антиген служит эффективным спейсером между поддерживающей матрицей и эпитопом. Как правило, если антиген был сшит с белком-носителем для облегчения продукции антител, наилучшие результаты получаются, когда антиген иммобилизован для аффинной очистки с использованием того же химического метода (например,g., реакция на первичные амины, сульфгидрилы, карбоновые кислоты или альдегиды). Таким образом, все эпитопы будут доступны для связывания антител, что позволит повысить эффективность очистки и восстановления специфического иммуноглобулина.

Пептидные антигены и аффинные лиганды

Большинство антител производится с использованием пептидных антигенов, которые были синтезированы и конъюгированы с иммуногенным белком-носителем, таким как KLH.Такие антигены можно настроить так, чтобы они содержали уникальную функциональную группу (дескриптор) как для конъюгации, так и для иммобилизации. С этой целью часто добавляют терминальный цистеин; он обеспечивает сульфгидрильную группу для эффективной конъюгации с активированным малеимидом белком-носителем и иммобилизации на йодацетил-активированной агарозной смоле (смола SulfoLink Coupling).

Другой распространенной стратегией является использование смолы, функционализированной амином, и сшивающего агента EDC для иммобилизации пептидов через их карбоксильные (C-концевые) аминокислоты.Поскольку пептиды имеют как аминные, так и карбоксильные концы (а также, возможно, внутренние лизины, остатки аспартата или глутамата), сшивание карбоксильных групп с амином, вызванное EDC, как полимеризируется, так и иммобилизует пептид, так что он представлен антителу в различных формах. ориентации для связывания сродства. Это основа набора для иммобилизации CarboxyLink.

Белковые антигены и аффинные лиганды

За исключением особых случаев, белковые антигены обычно легче всего иммобилизовать для аффинной очистки путем нацеливания на первичные амины, которые обычно встречаются в нескольких местах на внешней поверхности белковых структур (т.е.е., везде, где есть лизиновые группы или N-конец субъединицы). Для такого рода иммобилизации доступно несколько высокопроизводительных аффинных носителей, способных реагировать с амином.

В качестве альтернативы, если белковый антиген представляет собой очищенный гликопротеин и углеводные группы не являются интересующими эпитопами, то антиген может быть ковалентно иммобилизован через сахарные группы после того, как они были окислены периодатом натрия. Это основа набора для иммобилизации GlycoLink.

Условия связывания и элюирования

Существуют небольшие различия между типичными условиями связывания и элюирования для антиген-специфической аффинной очистки антител, поскольку они основаны на естественных аффинных взаимодействиях антител с их соответствующими антигенами.То есть, поскольку антитела предназначены для распознавания и прочного связывания антигенов в физиологических условиях, в большинстве процедур аффинной очистки используются условия связывания, имитирующие физиологический pH и ионную силу. Наиболее распространенными связывающими буферами являются фосфатно-солевой буфер (PBS) и Трис-буферный солевой раствор (TBS) при pH 7,2. После связывания антитела с иммобилизованным антигеном используется дополнительный связывающий буфер для смывания несвязавшегося материала с подложки. Чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание, многие исследователи используют промывочный буфер, содержащий дополнительную соль или детергент, чтобы нарушить любые слабые взаимодействия.

Специфические очищенные антитела можно элюировать из аффинной смолы путем значительного изменения pH или ионной силы буфера, чтобы нарушить антигенсвязывающее взаимодействие. Большинство антител представляют собой умеренно эластичные белки, которые переносят диапазон pH от 2,5 до 11,5 без постоянной инактивации, и низкий pH является наиболее распространенной стратегией элюирования. В некоторых случаях взаимодействие антитело-антиген не нарушается эффективно из-за изменений pH или нарушается из-за pH, что требует использования альтернативной стратегии.


Ссылки

  1. Grodzki, A.C., Berenstein, E. (2010). Очистка антител: фракционирование сульфатом аммония или гель-фильтрация. В: C.Oliver and M.C. Джамур (ред.), Иммуноцитохимические методы и протоколы, Методы молекулярной биологии, Vol.588: 15–26. Humana Press.
  2. Харлоу, Э. и Лейн, Д. (1988). Антитела: лабораторное руководство. Пресса лаборатории Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк, Ганьон, П. (1996).
  3. Ганьон, П.С. (1996). Инструменты для очистки моноклональных антител. Проверенные биосистемы. Тускон, Аризона.
  4. Nethery, A., et al. (1990). J. Immunol. Метод 126, 57-60.
  5. Nevens, J.R., et al. (1992). J. Chromatogr. 597, 247-256.
  6. Роке-Баррейра, М.К. и Кампос-Нето, А. (1985). J. Immunol. Метод 134 (30), 1740–1743.
  7. Aucouturier, P., et al. (1987). Мол. Иммунол. 24 (5), 503–511.

.

Форматы антител и очистки антител

Антисыворотка

Поликлональные антитела часто доступны в относительно неочищенных формах, описываемых как «сыворотка» или «антисыворотка». Антисыворотка относится к крови иммунизированного хозяина, из которой были удалены белки свертывания и эритроциты. Антисыворотка будет содержать антитела / иммуноглобулины всех классов, а также другие белки сыворотки.

Помимо антител, распознающих антиген-мишень, антисыворотка также содержит антитела к различным антигенам, не являющимся мишенями, которые иногда могут реагировать неспецифично в иммунологических анализах.По этой причине необработанную антисыворотку часто очищают для удаления белков сыворотки и для обогащения фракции иммуноглобулина, которая специфически реагирует с антигеном-мишенью.

Супернатант тканевой культуры

Моноклональные антитела можно выращивать как культуры гибридомных клеток (клетки, секретирующие цитокины) и собирать как супернатанты гибридомных тканевых культур. Для получения дополнительных сведений о том, как производятся гибридомы, см. Раздел, посвященный производству моноклональных антител.

Асцитная жидкость

Моноклональные антитела могут быть получены путем выращивания гибридомных клеток в брюшной полости мыши (или крысы).При введении мыши клетки гибридомы размножаются и производят жидкость (асцит) в ее брюшной полости. Эта жидкость содержит высокую концентрацию антител, которые можно собирать. Это обычно обеспечивает более высокий выход антител, чем культура клеток гибридомы.

Концентрации неочищенных антител

Препараты неочищенных антител значительно различаются по концентрации специфических антител. Если удельная концентрация антител в данном препарате неочищенных антител неизвестна, можно использовать следующие «типичные диапазоны» в качестве ориентира для оценки:

Надосадочная жидкость тканевой культуры Асцит Целая антисыворотка Очищенное антитело
WB / дот-блот 1/100 1/1000 1/500 1 мкг / мл
IHC / ICC чистый — 1/10 1/100 1 / 50–1 / 100 5 мкг / мл
EIA / ELISA 1/1000 1/10000 1/500 0.1 мкг / мл
FACS / Проточная цитометрия 1/100 1/1000 1/500 1 мкг / мл
IP 1 / 10–1 / 50 1/100 1 / 50–1 / 100 1–10 мкг / мл
Оценка концентрации 1–3 мг / мл 5–10 мг / мл 1 –10 мг / мл

Очищенные антитела

Поликлональная антисыворотка или моноклональная асцитная жидкость / супернатант тканевой культуры обычно очищают одним из двух методов:

Очистка белка A / G

Белок A При очистке / G используется высокая аффинность белка A Staphylococcus aureus или белка G Streptococcus к домену Fc иммуноглобулина.Очистка белка A / G удаляет основную часть белков сыворотки из сырой антисыворотки. Однако он не устраняет неспецифическую фракцию иммуноглобулина. В результате очищенная антисыворотка к белку A / G может по-прежнему обладать небольшой нежелательной перекрестной реактивностью.

Аффинная очистка

Аффинная очистка выделяет определенный белок или группу белков со схожими характеристиками. Этот метод разделяет белки на основе обратимого взаимодействия между белками и конкретным лигандом, связанным с хроматографической матрицей.

Очистка сродства к антигену использует преимущество аффинности фракции специфического иммуноглобулина к иммунизирующему антигену, против которого он был создан. Очистка сродства к антигену приводит к удалению основной части неспецифической фракции иммуноглобулина при одновременном обогащении фракции иммуноглобулина, которая специфически реагирует с антигеном-мишенью. Полученный аффинно очищенный иммуноглобулин будет содержать в первую очередь иммуноглобулин с желаемой специфичностью.

Список продуктов очистки антител от Abcam.

Предварительная адсорбция

Поликлональные антитела иногда предварительно адсорбируются. Это означает, что они были адсорбированы другими белками или сывороткой различных видов и т. Д., Чтобы устранить любые антитела, которые могут вступать в перекрестную реакцию. Полученное очищенное антитело должно быть очень чистым и специфичным, и любая перекрестная реактивность должна быть значительно снижена.

Вернуться к справочнику по антителам.

.

Антитело против GFAP — очищенное с помощью аффинности (ab211271)

Обзор

  • Название продукта

  • Описание

    Кролик, поликлональный к GFAP — Affinity Purified

  • Виды-хозяева

    Кролик

  • Протестированные приложения

  • Реактивность видов

    Реагирует с:
    Мышь, Крыса, Человек

  • Иммуноген

    Рекомбинантный полноразмерный белок, соответствующий GFAP.

  • Общие примечания

    В некоторых случаях антитело может иметь красный цвет. Это происходит из-за небольшого количества гемолиза и не влияет на характеристики антител.

Недвижимость

  • Форма

    Жидкость

  • Инструкции по хранению

    Поставляется при 4 ° C.Хранить при + 4 ° C кратковременно (1-2 недели). При доставке аликвота. Хранить при -20 ° C или -80 ° C. Избегайте цикла замораживания / оттаивания.

  • Буфер памяти

    Состав: PBS

  • Загрузка информации о концентрации …

  • Чистота

    Аффинно очищенный

  • Примечания по очистке

    Антитело было создано против полноразмерного рекомбинантного GFAP на основе человеческой последовательности, экспрессированной в E.coli.

  • Клональность

    Поликлональный

  • Изотип

    IgG

  • Направления исследований

Сопутствующие товары

  • Совместимые вторичные компоненты

  • Изотипический контроль

  • Рекомбинантный белок

  • Сопутствующие товары

Приложения

Наша гарантия Abpromise распространяется на использование
ab211271
в следующих протестированных приложениях.

Примечания по применению включают рекомендуемые начальные разведения; Оптимальные разведения / концентрации должны определяться конечным пользователем.

Приложение Отзывы Банкноты
WB 1/5000. Обнаруживает полосу примерно 55,48 кДа.
IHC-FrFl 1/1000 — 1/5000.

Цель

  • Функция

    GFAP, промежуточный филамент класса III, является клеточно-специфическим маркером, который во время развития центральной нервной системы отличает астроциты от других глиальных клеток.

  • Тканевая специфичность

    Экспрессируется в клетках, лишенных фибронектина.

  • Поражение болезнью

    Дефекты GFAP являются причиной болезни Александера (ALEXD) [MIM: 203450].Болезнь Александра — редкое заболевание центральной нервной системы. Это прогрессирующая лейкоэнцефалопатия, отличительной чертой которой является широко распространенное скопление волокон Розенталя, которые представляют собой цитоплазматические включения в астроцитах. Наиболее распространенная форма поражает младенцев и детей младшего возраста и характеризуется прогрессирующей недостаточностью центральной миелинизации, обычно приводящей к смерти в течение первого десятилетия. У младенцев с болезнью Александра развивается лейкоэнцефалопатия с макроцефалией, судорогами и задержкой психомоторного развития.Пациенты с юношескими или взрослыми формами обычно испытывают атаксию, бульбарные признаки и спастичность, а также более медленно прогрессирующее течение.

  • Сходства последовательностей

    Относится к семейству промежуточных волокон.

  • Посттрансляционные
    модификации

    Фосфорилирован PKN1.

  • Сотовая локализация

    Цитоплазма.Связан с промежуточными филаментами.

  • Информация от UniProt
  • Ссылки на базу данных

  • Альтернативные названия

    • wu: антитело fb34h21
    • ALXDRD антитела
    • антитело cb345
    • etID36982.3 антитело
    • FLJ42474 антитело
    • FLJ45472 антитело
    • Антитело к GFAP
    • Антитело GFAP_HUMAN
    • антитело gfapl
    • Глиальные фибриллярные антитела к кислому белку
    • Антитела к белку промежуточных филаментов
    • wu: антитело fk42c12
    • xx: af506734 антитело
    • zgc: 110485 антитело

    посмотреть все

Изображения

  • Immunohistochemistry - Free Floating - Anti-GFAP antibody - Affinity Purified (ab211271)

    Иммуногистохимия — Свободно плавающие — Антитело против GFAP — Очищенное сродством (ab211271)

    Иммуногистохимический (свободно плавающий) анализ окрашивания GFAP мозжечка крысы с ab211271 (1/5000) зеленым цветом и MeCP2 с мышиным моноклональным антителом (1/500) красным цветом.Синий — окрашивание ядерной ДНК DAPI. После транскардиальной перфузии крысы 4% параформальдегидом мозг подвергали последующей фиксации в течение 1 часа, разрезали до 45 мкМ и свободно плавающие срезы окрашивали указанными выше антителами.

  • Western blot - Anti-GFAP antibody - Affinity Purified (ab211271)

    Вестерн-блот — антитело против GFAP — очищенное с помощью аффинности (ab211271)

    Дорожка 1: Белковая лестница
    Дорожки 2-5: Антитело против GFAP — очищенное сродство (ab211271) при разведении 1/5000

    Дорожка 2: Мозг крысы
    Дорожка 3: Спинной мозг крысы
    Дорожка 4: Мозг мыши
    Дорожка 5: Спинной мозг мыши

    Сильная полоса около 50 кДа соответствует основному изотипу белка GFAP.Более мелкие изотипы и протеолитические фрагменты GFAP также обнаруживаются на блоте.

Список литературы (1)

ab211271 упоминается в 1 публикации.

  • Nunes NS et al. Терапевтический ультразвук ослабляет колит, вызванный DSS, за счет холинергического противовоспалительного пути. EBioMedicine 45: 495-510 (2019).

    PubMed: 31253515

Отзывы клиентов, вопросы и ответы

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *