Подготовка к криопротоколу: Как подготовиться к крио-протоколу и увеличить успех ЭКО — пишет Kate на BabyBlog

Как подготовиться к крио-протоколу и увеличить успех ЭКО — пишет Kate на BabyBlog

5 советов, которые помогут повысить шансы успешной имплантации и здоровой беременности в крио-протоколе и просто в протоколе ЭКО. (оригинал статьи)

1. Повысьте запас питательных веществ

Путешествие каждой женщины к материнству должно начаться со здоровой диеты в качестве основы. Женщины, которые готовятся к беременности должны есть натуральные продукты, богатые полезными веществами, а также ежедневно принимать пренатальные поливитамины, которые содержат по крайней мере 800 мкг фолиевой кислоты, чтобы увеличить свои шансы на успешную имплантацию и беременность.

Лучшими видами продуктов питания, являются цельные зерна, хорошие жиры (омега-3, кокосовое масло), темно-зеленые листовые овощи(шпинат) , много чистой воды, органические и свежие овощи и фрукты.

Узнайте все о диете фертильности здесь…

2. Очистите организм от токсинов

Это является отличным способом чтобы подготовить свое тело к здоровой беременности. Чтобы очистить организм от токсинов до беременности, способствовать гормональныому балансу и подготовить матку к имплантации используют определенные травы.

Нуждаетесь ли вы в очистке от токсинов?

Очищение длится полный менструальный цикл (28-30 дней), и должно быть завершено до начала приема препаратов в крио-протоколе.

Касторовое масло для чистки матки
Чтобы стимулировать маточное очищение, я призываю клиентов рассмотреть вопрос о применении компрессов касторового масла. Это ткань, смоченная в касторовом масле, которая прикладывается к животу, чтобы способствовать улучшению циркуляции крови в репродуктивных органах и стимулировать лимфатическую чистку этой области. Подробнее писала вот тут

Травы, очищающие печень:

Корень лопуха: Питание и очищение для печени, поддержка общей функции печени для улучшения гормонального баланса.

Расторопша (Milk tistle) Поддержка гормонального баланса. Это одно из лучших растений для здоровья печени. Здоровье печени является жизненно важным для гормонального баланса. Печень помогает фильтровать токсины из организма, в том числе избыточные гормоны.

Корень одуванчика: очень питательный и с высоким содержанием витаминов и минералов. Для здоровья печени, стимулирует пищеварение для улучшения гормонального баланса.

Желтокорень: Стимулирует производство желчи для здорового удаления токсинов, поддерживает здоровье печени, с высоким содержанием железа.

Корень солодки: является травой-адаптогеном, поддерживая эндокринную систему для общего гормонального балланса.

Корень имбиря: Увеличивает циркуляцию крови в организме, в поддержку здорового кровообращения и нормальной детоксикации.

Травы для очищения матки

Желтокорень: Противовоспалительное.Снижение воспаления может помочь предотвратить образование спаек и рубцовой ткани. Очищает матку.

Дамиана (лист): Женский афродизиак, была использована на протяжении веков, чтобы помочь увеличить кровообращение в репродуктивной системе, а также увеличить сексуальное удовольствие.

Dong quai: (дягиль лекарственный) — увеличивает циркуляцию, которая помогает притоку свежей здоровой крови, чтобы удалить рост лишней ткани, лечить повреждения тканей, ограничить рубцовую ткань и образование спаек.

Корень пиона: В целом это растение имеет отлично поддерживает баланс гормонов. Также помогает в сокращении боли и релаксации. Перемещает кровь в область малого таза, что хорошо для матки.

Листья малины: Малина работает, чтобы тонизировать мышцы матки и нормализовать кровоток во время менструации. Это одна из лучших трав для нормализации работы женских органов.

(Источник статьи)

3. Окажите содействие своему эндометрию.

Вы, наверное, спросите «Как сделать это?» На самом деле это довольно просто! Во-первых, убедитесь, что вы получаете достаточное количество железа. Чтобы создать богатую кислородом здоровую кровь, вы должны потреблять адекватные уровни железа. Продукты, богатые железом строят кровь. Употребляйте водоросли, пивные дрожжи, шпинат, чечевицу, сырые семена тыквы, курагу, патоку и свеклу. Исследования показали, что свекла также увеличивает здоровый приток крови к матке!Женщины с дефицитом железа, скорее всего, имеют выкидыш. Убедитесь, что вы потребляете 15 мг железа в день. Дефицит железа известен как анемия, а лучший способ предотвратить анемию — это есть продукты, богатые железом или дополнения железа.

Читайте на эту тему мой пост: Недостаток железа (ЖДА) снижает шансы на беременность на 60%, и влияет на качество ЯК

L-аргинин-одно из питательные веществ, которое стоит выше всех остальных для создания здорового эндометрия матки. L-аргинин способствует синтезу оксида азота (NO). Окись азота, естественно вырабатывается организмом и является важным для увеличения притока крови к матке, яичникам и половым органам. L-аргинин способствует созданию здоровой среды для имплантации. Одно исследование показало, что L-аргинин может улучшать шанс успешного ЭКО.

Примечание: L-аргинин не стоит принимать, если у вас есть герпес, т.к. это может вызвать его вспышку.

4. Иглоукалывание или акупунктура

Исследования показывают, что иглоукалывание (акупунктура) и до, и после переноса эмбрионов увеличивает шансы успешной имплантации и беременности. При иглоукалывании используют крошечные иглы, чтобы стимулировать различные точки в организме, которые помогают поддерживать различные системы. Иглоукалывание может использоваться, чтобы помочь управлять стрессом, и поддерживать тело, чтобы преодолеть дисбаланс, лежащий в основе проблем с зачатием. Иглоукалывание также поддерживает и поощряет здоровое репродуктивное кровообращение, здоровый эндометрий матки, гормональный баланс и многое другое.

В одном исследовании 114 женщин с аналогичными факторами бесплодия, проходящих ЭКО, были разделены на две группы. 53 получили иглоукалывание и 61 не получили. В группе иглоукалывания не было внематочных беременностей (в группе без иглоукалывания было 9%), меньше выкидышей (иглоукалывание группа -8%, не иглоукалывание группа 20%) и 51% достижения беременности для группы с иглоукалыванием в сравнении с 36% в группе без. Два исследования показали, что иглоукалывание влияет на успех ЭКО, когда сделано примерно во время переноса эмбрионов. Первое исследование опубликовано в Fertility & Sterility показали, что живорождение в два раза выше для тех, кто привык к электро-акупунктуре (также известной как чрескожная электрическая стимуляция). В группе без акупунктуры был 21% живой рождаемости, а в группе с иглоукалыванием- 42%.

В этом исследовании 309 женщин в возрасте от 21 до 44, проходящих ЭКО были случайно разделены на три группы:
1. группа плацебо,
2. Однократная обработка электро-акупунктурой- спустя 30 минут после переноса эмбрионов
3. группа двкукратной электро-акупунктуры — получали лечение за 24 часа до переноса эмбрионов, а также через 30 минут после переноса.

Результаты, % живорождений:
Группа 1 (плацебо): 21,2%
Группа 2 (однократное иглоукалывание): 37,3%
Группа 3 (двукратное иглоукалывание): 42%

Исследование 2
В другом исследовании с участием 273 пациентов, проходящих ЭКО, применяли иглоукалывание в день переноса эмбрионов

Группа 1: Иглоукалывание в день переноса эмбрионов (непосредственно до и после )
Группа 2: Иглоукалывание в день переноса эмбрионов (непосредственно перед и после передачи) и снова 2 дня спустя (ближе к дню имплантации)
Группа 3: контрольная группа,без иглоукалывания.

Результаты:
Группа 1: 39%
Группа 2: 36%
Группа 3: 26%

Это исследование показывает, что …
Иглоукалывание в день переноса эмбрионов значительно улучшает репродуктивный исход ЭКО по сравнению с отсутствием акупунктуры. Повторяя акупунктуру через два дня после переноса не дает никаких дополнительных преимуществ.

При использовании акупунктуры в подготовке к крио-протоколу, вы должны начать задолго до начала вашего протокола, идеально за 1-3 месяца. (Источник — последняя часть статьи)

Помимо акупунктуры (иглоукалывания), есть еще акупрессура- самомассаж, надавливание на определенные активные точки.

5. Сохраните спокойствие матки

Часто в течение нескольких дней после переноса эмбрионов бывают спазмы или судороги в матке. Многие женщины беспокоятся об этом. Чаще всего, судороги является признаком имплантации, особенно, если они чувствовались примерно на 6-7 ДПП.

Если катетер для переноса эмбриона в полость матки затрагивает стенку матки, могут произойти более тяжелые спазмы матки. (вообще, это не очень хорошо, когда вот так задевают стенку, снижается результативность попытки от этого).

Травы для расслабления матки в моем посте натуральные способы поддержать имплантацию

Предлагаю также почитать:

Натуральные методы повышения прогестерона

чек-лист анализов перед ЭКО, акцент на тех анализах, о которых врачи иногда не упоминают

Подготовка к ЭКО- пьем витаминки

подготовка и наблюдение беременности при тромбофилии
Гормональная терапия эстрогенами и риск тромбоза
Системные энзимы при подготовке к ЭКО

Эстрадиол в протоколе ЭКО

Подборка исследований по факторам, увеличивающим риск выкидыша

ЭКО и АФС синдром

Содержание

подготовка, этапы и выбор дня для переноса

Что такое криоперенос эмбрионов? Это перенос замороженных эмбрионов из тела матки во внешние условия и наоборот. С этой процедурой связано много тонкостей, в которых постараемся разобраться.

криоперенос эмбрионов

Криоперенос эмбрионов как процедура

В матку женщины подсаживают от одной до четырех яйцеклеток. Из указанного количества может прижиться 1,2,3,4 или не прижиться ни одна. Если имплантация прошла успешно и прижились сразу несколько эмбрионов, то по показаниям медиков и желанию женщины положено необходимое количество удалить — произвести редукцию эмбрионов. Удаленные из полости матки яйцеклетки замораживают. Если вдруг ЭКО не прошло успешно, то можно сделать еще дополнительные попытки с помощью замороженного биоматериала.

Благодаря процедуре криопереноса женщина не нужно будет проводить повторную стимуляцию организма для наступления процесса овуляции. Так же мужу женщины не придется сдавать повторно сперму. В итоге все процедура ЭКО будет короче.

Бывает так, что все подсаженные яйцеклетки жизнеспособны и нормально развиваются. В этом случае «лишних» убирают криопереносом.

В замороженном состоянии эмбрионы хранят в криохранилище. Данная услуга предлагается на платной основе. Так они могут храниться от одного месяца до нескольких лет. Супруги в любой желаемый для них момент смогут воспользоваться этим материалом.

Криоконсервация и размораживание

Под криоконсервацией понимают заморозку зародышей в жидком азоте при помощи криопротектора. Температура замерзания равняется -196ºС. Существует два вида замораживания:

  • Долгая криоконсервация. Особенности: температура уменьшается при замерзании постепенно. Процедура занимает несколько часов.
  • Пятнадцатиминутная витрификация. Особенности: весь процесс проходит очень быстро. То есть быстро замораживаются эмбрионы и быстро размораживаются.

Пятнадцатиминутный способ является самым лучшим, современным и эффективным. При нем выживает более восьмидесяти оплодотворенных яйцеклеток.

Замороженные яйцеклетки очень важно правильно разморозить. Повреждения от разморозки оценивает такой специалист, как эмбриолог. Практика показывает в достаточном количестве случаи, когда эмбрионы утрачивают до 50% своих клеток. Однако это исправляется в самом начале развития, еще до начальной стадии. Риск нанесения вреда здоровью плода отсутствует.

криоперенос эмбрионов ощущения

Этапы криопереноса

Криоперенос состоит из нескольких этапов:

  • Первый этап: разморозка эмбрионов и подготовка эндометрия к имплантации.
  • Второй этап: процедура переноса эмбрионов (проводится под контролем УЗИ).
  • Третий этап: поддержание с помощью лекарств посттрансферного периода.

Первый этап начинается с приема репродуктолога. Женщина и врач совместно обговаривают все моменты процедуры и условия криопереноса. В большинстве случаев доктор назначает УЗИ (проводится на 20-24 день) матки и самих придатков. Кроме этого, репродуктолог назначает допплерометрию матки, для того чтобы увидеть как проводится кровоснабжение сосудов и эндометрия. Если женщина уже пережила несколько неудачных попыток, то ей назначают дополнительные обследования и консультации узкого специалиста.

Второй этап — это сам перенос. Яйцеклетки для оплодотворения могут использоваться как при естественном цикле женщины, так и совместно с гормональной терапией. Терапию гормоны проводят для роста слизистой матки. Третьим вариантом процедуры может быть использование блокады гипофиза. Из трех протоколов наиболее предпочтительным является естественный цикл.

Естественный цикл

Если женщина не имеет нарушений цикла и после обследования врачи убедились, что месячные идут нормально, врач обследует женщину с помощью ультразвука. На УЗИ доктор отслеживает увеличение доминантного фолликула и изменения в созревании эндометрия. Когда компьютер покажет, что фолликул достиг предовуляторных размеров, пациентка должна сделать тест на овуляцию. Если овуляция подтвердится, то лютеиновую фазу начинают поддерживать прогестероном. Параллельно этому отслеживают динамику и проводят анализ созревания эндометрия. Сама процедура переноса может проходить в разные дни. Если с эмбрионами была выполнена витрификация, то их подсаживают на третьи сутки. Если проходила заморозка бластоцитов, то на пятые.

криоперенос эмбрионов в естественном цикле

Гормональная терапия

Гормональная терапия назначается при следующих показаниях:

  • Бесплодие при эндокринном нарушении.
  • Отсутствие у женщины спонтанной овуляции.

Гормональная терапия направлена на то, чтобы толщина эндометрия была не менее 7 мм. Структура у эндометрия должна быть трехслойной. При таких условиях шансы на перенос и приживаемость высоки.

Стимуляцию проводят гонадотропинами или натуральными эстрогенами. Так же назначают препараты на улучшение кровообращения в сосудах эндометрия и антиоксиданты.

Когда эндометрий примет необходимую структуру и толщину в процесс подготовки добавляют прогестерон. В случае выявления фолликула женщине вводят препарат хорионического гонадотропина, для того чтобы наступила овуляция.

Один момент: процедура криопереноса может проводиться на третьи или пятые сутки после того как наступила овуляция. Если у женщины ановулярный цикл, то в день приема прогестерона.

Выбор дня криопереноса

Для того чтобы эмбрион прижился в организме женщины, врач рассчитывает наилучший день для подсадки. При этом доктор обращает внимание на:

  • Сколько яйцеклеток будет готово к этому времени.
  • Возраст женщины.
  • Полный анамнез жизни женщины.
  • Были ли до этого переносы. Если да, то как они проходили.

Обычно доктора стараются сделать криоперенос пятидневных эмбрионов. В случае особенных факторов или сомнений переносятся трехдневные эмбрионы.

Сама процедура криопереноса

Размораживают эмбрионы за несколько часов до того, как подсадят в матку. Оживление эмбрионов происходит постепенно. После достижения ими необходимой температуры, до того как они оживут проходит несколько минут. Следующим шагом процедуры считается оценка их качества. Нельзя и не стоит переносить эмбрионы, в которых отсутствуют живые клетки. Так как показатели эмбрионов оцениваются изначально.

Дополнительной процедурой для облегчения вылупление эмбриона считается вспомогательный хетчинг. Он может быть механическим или химическим.

Перенос в полость матки эмбрионов осуществляют в стерильных условиях. Весь процесс контролируется с помощью препарата УЗИ. При этом мочевой пузырь у женщины должен быть наполнен в умеренном количестве. Процедура криопереноса безболезненна. Ее успех, результативность во многом зависит от четкой, грамотной, правильной работы врачей.

Перед самым переносом репродуктолог оценивает положение матки, длину ее полости и цервикального канала. Так же смотрит угол между маткой и шейкой. Оценка этих данных необходима для точности подсадки эмбриона. Самый оптимальный участок нахождения эмбриона считается полость матки на расстояние 15 мм от ее дна.

С помощью зеркал врач обнажает шейку и промывает ее раствором. Такое действе необходимо для удаления цервикальной слизи и прочих остатков. Далее врач открывает стерильный катетер и вводит внутрь проводник. Глубина введения должна быть до уровня внутреннего зева. После установки проводника, в катетер набирают эмбрионы и осуществляется перенос в помощью поршня. Момент, когда эмбрионы заходят в полость матки можно увидеть на экране монитора аппарата УЗИ. В течение одного часа пациентка должна полежать и отдохнуть.

что такое криоперенос эмбрионов

Как себя вести после криопереноса эмбрионов

  • Первый совет: нельзя напрягаться физически и истощаться морально. Любые волнения недопустимы.
  • Второй совет: нужно стараться черпать из окружения только положительный эмоции.
  • Третий совет: необходимо быть уравновешенной, чаще отдыхать и крепко спать. Только при этих условиях плод будет правильно развиваться.
  • Четвертый совет: необходимо стараться постоянно находиться в окружении родных сердцу людей.

Кроме вышеперечисленного, женщине после процедуры переноса эмбрионов нельзя садиться в горячую ванну и принимать душ. Недопустимо поднимать тяжелые предметы, резко наклоняться и водить автотранспортные средства. До момента проведения теста на беременность нельзя входить в сексуальную связь. Недопустимы в этот период любые физические нагрузки. Весь образ жизни должен быть спокойным и размеренным. Следует правильно питаться (делать упор на фруктовые и овощные соки) и носить вещи свободного покроя из натуральных тканей. Кроме этого, следует регулярно, по предписанию посещать врача.

Достоинства и недостатки

К плюсам криопереноса относят:

  • Минимальный риск по преждевременному старению яичников и их гиперстимуляции.
  • Хранение зародышей не отражается на качестве эмбрионов.
  • Дата имплантации не зависит от менструального цикла.
  • Вероятность приживания эмбрионов достигает высокого предела.
  • Криоперенос дает хорошую жизнеспособность эмбрионам.
  • Процедура криоконсервации может позволить забеременеть от мужа, который уже потерял способность к зачатию.
  • Способность зародышей не зависит от срока их хранения.
  • Для проведения следующих попыток не нужно ждать зрелости фолликул, выхода яйцеклетки и не нужно делать пункцию фолликул.

К минусам криопереноса относят:

  • Большие расходы, связанные с криохранением эмбрионов.
  • Есть случаи гибели всех эмбрионов после разморозки (но это редкость, всего 5%).
  • Низкая статистика беременности после криопротокола.

подготовка к криопереносу эмбрионов

Ощущения после криопереноса эмбрионов

После процедуры женщину могут мучить: вздутие живота, сильное потоотделение, тошнота, сонливость. Это обычная гормональная перестройка организма, в случае наступления беременности. Если симптомы не сильно мучают, то беспокоиться не стоит.

Еще одним признаком наступившей беременности считается «тянущий живот». Тянущие ощущения могут беспокоить женщину сразу после криопереноса. Это связано с тем, что эмбрион вводится через катетер, который нарушает изогнутую форму матки. Неприятные боли могут напрягать женщину в течение нескольких часов после процедуры. В этом случае лучше выпить обезболивающие.

При тянущем животе необходимо предпринять следующие:

  • Не стоит серьезно и мучительно переживать, так как это признак долгожданной беременности.
  • Убрать любые стрессогенные факторы. Они могут быть причиной выкидыша.
  • Гулять на улице медленным шагом в течение 2 часов. Прогулки должны быть ежедневными (желательно среди деревьев или в лесу).
  • Необходимо спать не менее 8 часов.
  • Рекомендуется пить перед сном успокоительные препараты.
  • Если боль нестерпимая, в срочном порядке нужно обратиться к врачу. Случается так, что перенесенный эмбрион не совместим с организмом женщины. Последний его просто отторгает, как инородное тело.

Прогноз на результат

Забеременеть после криопереноса по статистике получается после третьего перенесенного эмбриона. Успех зависит от метода заморозки, качества зародышей, профессионализма врачей и используемого оборудования.

Благодаря криопереносу на свет появляются огромное количество детей. Врачи говорят о том, что они не отличаются от детей, зачатых в естественных условиях.

Отзывы

Мне делали криоперенос. На радость всем получилось с первого раза. Беременность протекала без серьезных и опасных проблем. Ныл живот только в первом триместре. Сейчас перед глазами моя ляля, которая мило сопит в кроватке. Спасибо современной медицине за это!

Наблюдались и лечились в лучшей клиники России. Делали три попытки. Это было жуткое время. Сначала мне подсаживали живые эмбриончики, а последние два раза замороженные. Первые разы запускали в меня по три эмбриона, а последний раз – четыре. И вот это четвертый и прижился. Жизнеспособный оказался. Я на седьмом небе от счастья. Когда я ехала в клинику, я совсем не верила больше в крио. Ревела. Муж злился. Ему, мужику, не понять материнского инстинкта. Подумывала тогда я и о суррогатной матери. Но жутко хотела сама. Сейчас моей беременности 21 неделя. В ожидании. Осталось только доносить до конца мою кроху.

Шансы забеременеть после криопереноса высоки, так как процедура дает парам возможность предпринять несколько попыток зачатия. А это существенно повышает вероятность наступления беременности.

Какие гормональные препараты вы принимали для стимуляции овуляции?

Poll Options are limited because JavaScript is disabled in your browser.

  • Гонал 33%, 3743 голоса

    3743 голоса 33%

    3743 голоса — 33% из всех голосов

  • Клостилбегит 25%, 2837 голосов

    2837 голосов 25%

    2837 голосов — 25% из всех голосов

  • Менопур 16%, 1807 голосов

    1807 голосов 16%

    1807 голосов — 16% из всех голосов

  • Пурегон 14%, 1613 голосов

    1613 голосов 14%

    1613 голосов — 14% из всех голосов

  • Прегнил 8%, 955 голосов

    955 голосов 8%

    955 голосов — 8% из всех голосов

  • Меногон 3%, 345 голосов

    345 голосов 3%

    345 голосов — 3% из всех голосов

Всего голосов: 11300

Голосовало: 8307

17 января, 2018

×

Вы или с вашего IP уже голосовали.

Моя подготовка к удачному крио переносу — пишет NastikN на BabyBlog

Этот пост я решила написать для себя, чтобы не забыть, что я делала и, конечно, для девочек, которые ищут на просторах интернета подготовку к крио или свежему протоколу. Сама потратила не мало времени в поисках «чего бы еще сделать, чтобы подстелить соломинку». Конечно, именно моя схема всех методов может не подойти в другой конкретной ситуации. Все индивидуально.

Напишу здесь все основательно, все, что я делала, даже перед пролетным протоком летом 2018, т.к. считаю, что это тоже сыграло не маловажную роль. Диагноз «Первичное бесплодие неясного генеза»., более 10 лет.

Началось все с того, что я сменила клинику (до этого у меня было два пролетных свежих с переносом трехдневок и ничегошеньки в крио), где меня сразу направили на гистеру. После гистеры подтвердили ХЭ и больше ничего не нашли.

Перед лечением летим отдыхать в Тайланд и набираемся новых сил)))

За три месяца до протокола начинаю принимать витаминки и БАДы для улучшения качества моих клеточек https://www.babyblog.ru/community/post/sterility/3202947

Далее мы приступаем к трехмесячному лечению моего ХЭ. Схема здесь https://www.babyplan.ru/basal/diary/2018/5/5/

На третий месяц лечения ХЭ делаю внутриматочные УЗ кавитации в первой половине цикла, а во второй половине цикла курс физиотерапии и пиявки. Схема здесь https://www.babyblog.ru/user/NastikN/3401011. Пока лежала на кавитациях наконец-то вышила «Почти идеальный»))

И в конце июля вступаю в свежий протокол, в котором наконец-то получаем 3 пятидневочки. 4ав и 3вв мне перносят, а 5аа остается в крио. Кстати, на переносе я почему то была очень рада именно этой 5аа, но потом осекла себя, стало стыдно перед крохами, которые готовились к переносу. В протоколе пишу письмо в Зачатьевский монастырь с просьбой прислать мне поясок Пресвятой Богородицы. А на 8 ДПП мне приходит этот поясок. Но чудо в этот протокол, к сожалению, не случилось.

Руки не опускаем, меня ждет моя снежиночка)) Решили отдохнуть три цикла, ну как отдохнуть, с небольшой подготовкой конечно.

Начинаю пить Ортилиду (хорошие отзывы при лечении ХЭ и миом).

Через цикл после протокола подключаю опять лонгидазу ректально, а утром натощак по чайной ложечке Струя бобра. Ужасная дрянь, но чего только не выпьешь и не съешь ради результата))) Также делаю допплер малого таза, там все в норме.

За цикл до крио.

Также продолжаю Ортилиду. Начинаю делать ЛИТы с донором, а с 15 ДЦ Пиаскледин (прочитала тут на ББ, что он хорош для рецептивности эндометрия)

И вот вступаю в криопротокол. Тут я тоже не сидела сложа руки)). До переноса грела ножки для кровообращения в малом тазу. С 1 по 10 ДЦ свечи Корелип ректально (для насыщения эндометрия кислородом). Ну а на перенос я пошла вообще подготовленная, в красных трусах и полосатой сорочке))

Вроде ничего не забыла. Если вспомню еще, то буду дополнять.

А здесь мои наблюдения по дням после переноса, если кому-то интересно будет)

https://www.babyblog.ru/user/NastikN/3405091

И небольшое отступление по причинам неудач. Почему у самих не получается я так и не могу ответить сама себе на этот вопрос, даже мыслей никаких нет. А вот все пролеты в свежих я списываю на непопадание в имплантационное окно. Фолики созревали быстрее и пункция проходила на 2 дня раньше, чем обычно моя О, соответственно и переносы были раньше. Хотя, конечно, утверждать тоже не могу.

Буду очень рада, если кому то, эти много букв помогут!))

Подготовка к крио-протоколу. — Ответы на частые вопросы от клиники «АРТ-ЭКО»

Вопросы: Какие прогнозы могут быть по таким «взрослым» эмбрионам, как они переносят разморозку в среднем по статистике? Какие анализы следует сдать перед криопротоколом и для оценки гемостаза помимо РМФК?

Сколько времени требуется для востановления после гиперстимуляции и по каким критериям оценивается состояние (УЗИ-картина, гормоны..)?

Мой диагноз СПКЯ. Был короткий протокол (в одной из гос. клиник по квоте), с которого меня сняли сразу же после пункции, случилась тяжелая гиперстимуляция. Было спунктировано 20 ооцитов, вырастили 3 бластоцисты 2 пятидневки и 1 семидневка. В начале цикла последовавшего за протоколам по УЗИ яичники очень сильно увеличены с множеством функциональных кист. В выписке из стационара указано, что не в норме только 1 показатель — РМФК. Я должна была ехать в крио-протокол в следующем же цикле, но оценив своё состояние взяла небольшую передышку. Сейчас отдыхаю, не принимаю никаких лекарств кроме метформина (прописал эндокринолог для лечения СПКЯ). С врачем-репродуктологом контакта нет. Помогите мне разобраться…

 

Ответ: Криопротокол можно начинать сразу со 2-3 дня менструации после отмены свежего протокола. Иногда по субъективному состоянию и данным УЗИ— размерам яичников, показателям гемостазиограммы, криопротокол можно перенести на следующий МЦ. КРИОпрограмма проводится без стимуляции яичников, двумя протоколами : с десенситизацией — на 20-21 дМЦ однократная в/мышечная инъекция диферелин-депо, люкрин-депо…, через 15-17 дней от момента инъекции начинается прием прогиновы; на 2-3 дМЦ сразу начинается прием прогиновы без десенситизации. Результативность обоих протоколов практически одинаковая, выбор программы осуществляется лечащим врачом на основании данных свежего протокола. Перенос эмбрионов назначается в программе с учетом возраста эмбрионов и имплантационного окна.

Что касается разморозки эмбрионов, все зависит от качества замороженных эмбрионов. Бластоцисты более капризны к замораживанию-размораживанию. Но часто бывает, что заморожена одна бластоциста — размораживается — переносится — наступает беременность. Когда «заморожено» более одной бластоцисты, шансы выше. Как правило, результативность криопрограмм меньше результативности свежего протокола. Это связано с вероятностью отмены криопереноса в связи с лизисом эмбрионов. Бластоцисты пятым днем часто дают беременность. Какого-то особенного обследования перед криопротоколом не требуется — мазок на флору, бакпосев, гемостазиограмма. Удачи!

Подготовка к криопотоколу ЭКО — анализы

Криопротокол экстракорпорального оплодотворения, представляет собой особую разновидность репродуктивных вспомогательных методик, которая подразумевает под собой имплантацию оплодотворенных яйцеклеток, ранее подвергнутых криозаморозке.

Готовые эмбрионы являются результатом той гормональной стимуляции, которую проводили женщине, желающей иметь ребенка. Криопротокол экстракорпорального оплодотворения является серьезной и ответственной процедурой, успех которой во многом зависит от качества проведенной подготовки.

Особенности

Каждой женщине, которая приняла решение использовать данную методику для достижения физиологической беременности, рекомендовано следовать любым советам медицинского специалиста. Только последовательное выполнение данных рекомендаций, позволит в полной мере подготовить женский организм к внедрению размороженных эмбрионов.

Самостоятельный подбор и коррекция дозировок лекарственных препаратов находится под запретом, так как подобные эксперименты приводят к тяжёлым гормональным сбоям в организме и формированию проблем, несовместимых с протоколом. Любые биологически активные добавки и витамины, должны быть согласованы с лечащим врачом. Медицинские специалисты считают сложными крио протоколы ЭКО, подготовка к которым занимает некоторое время.

Диагностика

Каждую пациентку интересует вопрос о том, какие анализы нужно сдать перед криопротоколом для оценки состояния организма. Перед началом использования криопротокола для достижения физиологической беременности, с целью оценки состояния женского организма, пациентке назначают целый ряд диагностических мероприятий.

Данный этап включает в себя функциональную и лабораторную диагностику. Лабораторные анализы перед криопротоколом экстракорпорального оплодотворения, включают в себя такие процедуры, как биопсия слизистой оболочки полости матки (эндометрия) и гистероскопия.

Функциональная диагностика в подготовительном этапе включает в себя УЗИ перед протоколом ЭКО для оценки состояния слизистой оболочки полости матки. В ходе данной процедуры медицинский специалист оценивает готовность эндометрия женщины к имплантации размороженного эмбриона.

Кроме того, подготовительный этап включает принятие женщиной лекарственных препаратов, способствующих созданию благоприятной среды в маточной полости для успешной имплантации яйцеклетки.

Для некоторых женщин актуальна медикаментозная блокада гипофизарных функций, а у некоторых пациенток отсутствует данная необходимость. Использование методики блокады ведется под строжайшим контролем лечащего врача. Такая ЭКО подготовка к протоколу ЭКО необходима для профилактики отторжения готового эмбриона.

Рекомендации

Многие женщины, столкнувшиеся с необходимостью использования вспомогательных репродуктивных методик, интересуются вопросом о необходимости коррекции образа жизни и прохождения специальной подготовки к данной манипуляции. Для таких женщин составлен общий перечень специальных рекомендаций, которые позволят вести дополнительную подготовку организма к реализации криопротокола.

Стандартная подготовка к криопротоколу предусматривает такие советы:

  • Ежедневное употребление достаточного количества жидкости не менее 1,5 л;
  • Регулярное дробное питание, включающее повышенное количество свежих овощей и фруктов;
  • Временный отказ от ведения половой жизни;
  • Умеренные физические и психоэмоциональные нагрузки;
  • Отказ от приема лекарственных медикаментов, которые не предусмотрены криопротоколом экстракорпорального оплодотворения.

Важно помнить, что отмена препаратов не должна сопровождаться ухудшением общего состояния женщины.

За сутки до ЭКО

За сутки до предполагаемой имплантации размороженных эмбрионов, не требуется проведение специализированных мероприятий. Пациентке лишь рекомендована такая подготовка к протоколу к ЭКО манипуляции:

  • Сон не менее 8 часов в сутки;
  • Полное исключение физических и психоэмоциональных перегрузок;
  • Избегание переохлаждения с целью профилактики респираторной вирусной инфекции;
  • Профилактика воздействия других неблагоприятных факторов на организм.

В день ЭКО

Заключительная подготовка к протоколу ЭКО приходится на день непосредственного переноса размороженных эмбрионов. Для успешной реализации данного метода, женщине рекомендовано:

  • За 2 часа до выполнения манипуляции выпить около 2 стаканов обычной воды;
  • Накануне утром необходимо принять душ;
  • До момента имплантации оплодотворенных яйцеклеток, пациентке необходимо сдать анализ венозной крови на уровень концентрации прогестерона и эстрадиола.

После процедуры

Если пациентка использует криопротокол, подготовка играет важнейшую роль. Когда женщина прошла манипуляцию по пересаживанию размороженных оплодотворенных яйцеклеток, ей необходимо продолжать соблюдение щадящего режима. На потенциальный успех данной процедуры оказывают влияние такие факторы, как физическая и психологическая нагрузка, достаточность сна, а также другие индивидуальные особенности женского организма.

Нередко, женщины интересуются теми ощущениями, которые могут у них возникнуть на фоне удачной реализации криопротокола экстракорпорального оплодотворения. В этом вопросе всё является индивидуальным. Определенный процент женщин не предъявляет каких-либо симптомов, связанных с удачным поведением данной манипуляции.

Другая часть пациенток может предъявлять жалобы на перечень таких изменений:

  • Болезненные ощущения и дискомфорт в молочных железах, а также увеличение их размеров;
  • Учащение позывов к мочеиспусканию;
  • Ноющая боль и дискомфорт в нижней части живота.

Общее состояние пациентки напрямую зависит от разновидности выбранного криопротокола. Если процедура осуществлялась в условиях естественного менструального цикла, то какого-либо дискомфорта или болезненных ощущений может и не быть.

При осуществлении заместительной гормональной терапии, симптоматика может нарастать и отличаться по своему разнообразию. Если имплантация оплодотворённой яйцеклетки прошла успешно, и наступила физиологическая беременность, то женщина ощущает ряд таких симптомов:

  • Головокружение;
  • Тошнота и рвота;
  • Частые смены настроения, связанные с влиянием гормонального фактора на психоэмоциональный фон.

Для того чтобы удостовериться в успешном проведении криопротокола экстракорпорального оплодотворения, женщине рекомендовано сдать лабораторные анализы для криопротокола на уровень ХГЧ. Кроме того, рекомендовано повторное ультразвуковое исследование.

Советы (видео)

Поделиться:

Криобанк №1 в Беларуси

Более 50 лет можно было сохранить ваш биологический материал, чтобы через некоторое время использовать его для беременности, и для этого существуют криобанки.

Что такое криобанк и криоконсервация?

Криобанк

— это специальное хранилище, где биологический материал тщательно хранится в течение многих лет в замороженном состоянии в специальной среде с жидким азотом при температуре -196 ° C.

Криоконсервация — это сверхбыстрое замораживание яиц, сперматозоидов, эмбрионов и тканей половых органов с сохранением их биологических функций после периода хранения и оттаивания.

Центр репродуктивного здоровья Bina имеет собственный криобанк, который позволяет хранить и хранить зародышевые клетки и эмбрионы в течение длительного времени и бережно.

Зачем это нужно?

Программа для замораживания половых клеток и эмбрионов позволяет:

  • Значительно увеличьте шансы на беременность в циклах АРТ, поскольку возможна задержка переноса эмбрионов и подготовка тела женщины, например, в случае синдрома гиперстимуляции яичников, «тонкого» эндометрия и острых заболеваний.
  • «Задержка материнства» до удобного для беременности времени. Женщины заморозили яйца в молодом возрасте. Действительно, с каждым годом жизни явно активной женщины количество яиц постепенно уменьшается, что приводит к тому, что через 42-44 года шансы естественного зачатия близки к нулю.
  • Для поддержания своей репродуктивной функции после некоторых заболеваний, таких как рак, требующий химиотерапии, лучевой терапии, генитальной хирургии: естественное зачатие становится невозможным.
  • Создать банк половых клеток с донорскими яйцеклетками и спермой для использования в программах АРТ для пар, страдающих тяжелыми формами бесплодия, или для одиноких женщин.

Кто может пользоваться услугами криобанка?

  • Любой человек, который хочет сохранить свои молодые яйца и сперму и использовать их позже для родов;
  • донор зародышевой клетки;
  • человек с раком до начала лечения;
  • Женщина, участвующая в программах ЭКО, когда необходима задержка переноса эмбрионов, например, если требуется дополнительная подготовка женщины или преимплантационный генетический диагноз.

Как происходит криоконсервация?

В центре Бина зародышевые клетки и эмбрионы замораживаются только путем витрификации.

Суть метода заключается в том, что клетки или эмбрионы погружаются в специальный крио-раствор, который охлаждается в среде с жидким азотом при очень низких температурах, и в результате биологический материал превращается в стеклообразную структуру.

Эта техника почти полностью устраняет образование кристаллов льда, которые разрушают клетки и ткани.

Безопасно ли замораживание для половых клеток и эмбрионов?

Метод витрификации идеально подходит для криоконсервации, поскольку после оттаивания до 90% эмбрионов яйцеклетки и сперматозоиды продолжают свое нормальное развитие.

Влияет ли замерзание на здоровье моих детей?

Согласно многолетним исследованиям, физическое и нервно-психическое развитие детей, рожденных вовремя, но с использованием различных методов АРТ, не отличается от здоровья обычных детей.

Кроме того, при переносе замороженных эмбрионов частота преждевременных родов и связанных с ними осложнений ниже.

Что если я захочу заморозить яйца для будущего использования?

Для проведения криоконсервации ооцитов женщина должна обратиться в центр Бина, где выполняются следующие манипуляции:

  • Медицинский осмотр для исключения противопоказаний к операции;
  • Стимуляция овуляции с помощью гормональных препаратов и под контролем УЗИ для одновременного созревания нескольких яиц;
  • Фолликулярная пункция и аспирация яйца при внутривенной анальгезии;
  • В течение двух часов после пункции яйца замораживаются и помещаются в криогенное хранилище, где они могут храниться до 10 лет.

Как я могу заморозить мою сперму?

Для мужчин все намного проще: после короткого медицинского осмотра и 3-4-дневного периода воздержания мужчины могут сдать сперму для криоконсервации.

Важно отметить, что в случае использования гормональных препаратов или антибиотиков замораживание сперматозоидов должно проводиться не ранее, чем через 15 дней после прекращения их приема.

Когда я могу использовать свои половые клетки или эмбрионы?

Каждый раз, когда вы решаете завести ребенка.Однако, согласно нормативным документам, срок годности половых клеток и эмбрионов в Республике Беларусь не может превышать 10 лет.

Кто отвечает за качество хранения моего биологического материала?

Наш центр несет полную ответственность за качество всех процедур криоконсервации, хранения и оттаивания зародышевых клеток и эмбрионов, что позволяет человеку использовать их даже через несколько лет.

Все действия, связанные с криоконсервацией половых клеток и эмбрионов, регулируются Указом Министерства здравоохранения Республики Беларусь №.54 от 01.01.2012 г. «О некоторых вопросах использования вспомогательных репродуктивных технологий».

,Протокол

для подготовки и флуоресцентного окрашивания ICC клеток на покровных стеклах: R & D Systems

Следующий протокол иммуноцитохимии (ICC) был разработан и оптимизирован лабораторией IHC / ICC R & D Systems для экспериментов ICC с использованием клеток, выращенных на покрытых желатином стеклянных покровных стеклах ,

Этот протокол ICC предоставляет основное руководство для подготовки, фиксации и флуоресцентного окрашивания клеток на стеклянных покровных стеклах. Каждый исследователь должен определить точные экспериментальные условия, необходимые для генерации сильного и специфического сигнала для каждого интересующего антигена.Если используются первичные антитела R & D Systems, пожалуйста, обратитесь к паспорту продукта, чтобы получить рекомендуемые рабочие разведения. В протоколе окрашивания визуализация сигнала достигается с использованием флуоресцентных вторичных антител и реагентов R & D Systems. Для всех других реагентов, пожалуйста, следуйте инструкциям производителя.

Пожалуйста, прочитайте протокол ICC полностью перед началом.

Иммуноцитохимический протокол для приготовления покровного стекла с использованием желатина

Многие культивируемые типы клеток плохо прилипают к стеклянным покровным стеклам.Добавление тонкого слоя желатина на покровное стекло усиливает адгезию культивируемых клеток к стеклу.

Требуются реагенты
  • Раствор желатинового покрытия: 0,1% желатина в деионизированном H 2 O
Материалы
  • Накладки (стерилизованные)
  • Планшет для культивирования клеток (6- или 24-луночный)
иммуноцитохимический протокол покровного стекла
  1. Поместите стерилизованные покровные стекла в лунки 24-луночного планшета.
  2. Добавьте 400 мкл раствора желатинового покрытия и инкубируйте покровные стекла в течение 10 минут при комнатной температуре.
  3. Удалите раствор желатинового покрытия и высушите покровные стекла на воздухе в течение 15 минут.
  4. Высохшие покровные стекла теперь можно хранить при комнатной температуре до использования.

Иммуноцитохимический протокол для подготовки и фиксации клеток на покровных стеклах

Требуются реагенты
  • 1X PBS: 0,145 М NaCl, 0,0027 М KCl, 0.0081 M Na 2 HPO 4 , 0,0015 M KH 2 PO 4 , pH 7,4
  • Фиксированный раствор формальдегида : 2-4% параформальдегида в PBS
  • Промывочный буфер: 0,1% BSA в 1X PBS
  • Среда для культивирования клеток
Материалы
  • Покрытые желатином покровные стекла в 24-луночном планшете
Иммуноцитохимия Протокол подготовки и фиксации
  1. Культуральные клетки путем добавления 500 мкл культуральной среды, содержащей приблизительно 5000 клеток, в лунки планшета для культивирования клеток, содержащие покрытые желатином покровные стекла.
  2. Когда клетки достигнут желаемой плотности / возраста, удалите питательную среду из каждой лунки и дважды промойте PBS.
  3. Добавьте 300-400 мкл 2-4% раствора фиксатора формальдегида в каждую лунку и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.
    Примечание: некоторые типы клеток могут быть повреждены изменением поверхностного натяжения, которое происходит, когда культуральная среда полностью удаляется и заменяется промывочным буфером. Если это так, предварительно зафиксируйте клетки, добавив 500 мкл 4% раствора фиксатора формальдегида непосредственно в культуральную среду.Через 2 минуты замените культуральную среду для предварительной фиксации 300-400 мкл 2% раствора фиксатора формальдегида и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.
  4. Промыть лунки дважды PBS и накрыть 400 мкл промывочного буфера. Покровные стекла можно хранить при температуре 2–8 ° C до 3 месяцев или сразу же окрашивать.
    Примечание: Фиксация может привести к гидрофобному сшиванию тканевых белков. Время, температура, pH и используемый фиксатор будут определять степень сшивки.После оптимизации протокола фиксации эту же процедуру следует использовать последовательно.

Иммуноцитохимический протокол для флуоресцентного окрашивания культивируемых клеток на покровных стеклах

Требуются реагенты
  • первичных антител
  • Блокирующий буфер: 10% нормальная сыворотка от осла, 0,3% Triton® X-100
  • DAPI (4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол) раствор: добавьте 1 мкл 14,3 мМ исходного раствора на каждые 5 мл PBS. Храните любые неиспользованные DAPI при 2-8 ° C, завернутые в алюминиевую фольгу
  • деионизированный H 2 O
  • Буфер для разведения: 1X PBS, 1% бычий сывороточный альбумин (BSA), 1% нормальная сыворотка осла, 0.3% Тритон Х-100 и 0,01% азида натрия
  • Средство для защиты от выцветания
  • Сопряженные вторичные реагенты (или эквивалент)
  • 1X PBS: 0,145 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0081 M Na 2 HPO 4 , 0,0015 M KH 2 PO 4 , pH 7,4
  • Промывочный буфер: 0,1% BSA в 1X PBS
Материалы
  • Покрытые клеткой покровные стекла в 6- или 24-луночном планшете
  • Тонкий пинцет
Протокол иммуноцитохимситрии

Примечание. Этот протокол оптимизирован для клеток, выращенных на покровных стеклах в 6- или 24-луночном планшете, но может быть соответствующим образом адаптирован.

  1. Вымойте покровные стекла, содержащие фиксированные клетки, два раза в 400 мкл промывочного буфера.
  2. Блокировать неспецифическое окрашивание путем добавления 400 мкл блокирующего буфера и инкубировать в течение 45 минут при комнатной температуре.
  3. Удалить блокирующий буфер. Полоскание не требуется.
  4. Развести неконъюгированное первичное антитело (или флуоресцентно-конъюгированное первичное) в буфере для разведения в соответствии с инструкциями производителя. Для флуоресцентного окрашивания ICC клеток на покровных стеклах с использованием антител R & D Systems рекомендуется инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа.В качестве альтернативы, инкубировать в течение ночи при 2-8 ° C.
    Примечание: соответствующие средства контроля имеют решающее значение для точной интерпретации результатов IHC / ICC. Все эксперименты IHC / ICC должны включать отрицательный контроль с использованием инкубационного буфера без первичного антитела для выявления неспецифического окрашивания вторичных реагентов. Дополнительные контроли могут применяться для подтверждения специфичности окрашивания, генерируемого первичным антителом. К ним относятся контроли абсорбции, контроли изотипа (для моноклональных первичных антител) и контроли типа ткани.
  5. Вымойте два раза в 400 мкл промывочного буфера. Если используется первичное антитело с прямым флуоресцентным конъюгатом, перейдите к шагу 8.
  6. Развести вторичное антитело в буфере для разведения в соответствии с инструкциями производителя. Добавить 400 мкл в лунки и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа в темноте. С этого шага образцы должны быть защищены от света.
    Примечание: NorthernLights TM флуоресцентные вторичные антитела и конъюгаты стрептавидина являются яркими, устойчивыми к фотообесцвечиванию и идеально подходят для многоцветной флуоресцентной микроскопии.
    Примечание: Если на этапе 4 использовалось биотинилированное антитело, примените конъюгированный со стрептавидином флуоресцентный зонд на этапе 6.
  7. Промыть два раза в 400 мкл промывочного буфера.
  8. Добавьте 300 мкл разбавленного раствора DAPI в каждую лунку и инкубируйте 2-5 минут при комнатной температуре. DAPI связывается с ДНК и является удобным ядерным контрассы. Он имеет максимум поглощения при 358 нм и флуоресцирует синим цветом при максимуме излучения 461 нм.
    Примечание: DAPI counterterstain может скрыть визуализацию мишеней, локализованных в клеточных ядрах.
  9. Промыть один раз PBS и один раз водой.
  10. Осторожно удалите покровные стекла из лунок и промокните, чтобы удалить лишнюю воду. Нанесите 1 каплю средства защиты от выцветания на предметное стекло для предметного стекла. Установите покровное стекло так, чтобы ячейки были направлены к предметному стеклу микроскопа.
  11. Визуализируйте, используя флуоресцентный микроскоп и наборы фильтров, соответствующие используемой этикетке. Слайды также можно хранить в коробке для слайдов при < -20 ° C для последующего изучения.
    Примечание. Первоначальные исследования IHC / ICC часто требуют дальнейшей оптимизации и / или дополнительных действий по устранению неполадок.

Triton является зарегистрированным товарным знаком Dow Chemical.

Связанные ресурсы IHC / ICC
IHC / ICC Реагенты

,

Пробоподготовка для аналитической характеристики

Правильная пробоподготовка является важным первым шагом во всех видах химических анализов.

Подходящая пробоподготовка необходима для снижения вероятности ошибки. Погрешность можно уменьшить несколькими способами: от выбора правильной стеклянной посуды до внимания к значимым цифрам в расчетах.

Для многих аналитических инструментов сначала должно быть подготовлено однородное решение интересующего образца. Процесс растворения — когда растворенное вещество растворяется в растворителе — позволяет сформировать гомогенный раствор, который затем может быть отобран для использования в одном или нескольких анализах.

Однако растворенный образец часто требует дополнительных стадий подготовки, прежде чем он будет готов для анализа. Эти методы, такие как фильтрация, экстракция или хелатирование, также могут быть выполнены до анализа.

Это видео продемонстрирует некоторые ключевые шаги в правильной подготовке образца для последующего химического использования.

Ошибки могут быть классифицированы как систематические или случайные. Случайные ошибки связаны с неожиданными изменениями, такими как условия окружающей среды, такие как ветер.

Систематические ошибки связаны со смещением экспериментатора или прибора. Этих ошибок при подготовке образца можно избежать, если обеспечить правильное использование как процедуры, так и устройств, таких как весы или пипетка.

При приготовлении раствора образца выбор растворителя важен и может основываться на требованиях используемого прибора. Некоторые инструменты требуют водных растворителей, в то время как другие требуют органических. Необходимо, чтобы образец растворился в выбранной жидкости.Растворимость является фактором межмолекулярных взаимодействий аналита с растворителем, и часто им можно манипулировать, изменяя тип растворителя, температуру или pH.

Раствор образца должен иметь точную концентрацию. Для приготовления раствора твердый образец взвешивается на аналитических весах, а не на стандартных весах с верхней загрузкой, для повышения точности. Если твердый образец гигроскопичен и содержит влагу, перед взвешиванием его необходимо высушить в сушильном шкафу или эксикаторе.

Если образец жидкий, его можно измерить по весу или объему. При использовании измерений объема обязательно используйте мерную колбу, поскольку при использовании другой измерительной стеклянной посуды, такой как объемный цилиндр с большими градуировками, могут возникнуть ошибки. В качестве альтернативы можно использовать стеклянную объемную пипетку. Они обычно калибруются для обеспечения одного точного объема с последней каплей, остающейся в пипетке.

Для приготовления раствора точно измеренный образец растворяют в мерной колбе.Сначала для растворения образца используйте меньше, чем конечный объем растворителя. После смешивания осторожно добавьте дополнительный растворитель, чтобы довести раствор до его окончательного объема.

После растворения большей части образца в растворителе все еще могут присутствовать твердые вещества, которые необходимо удалить перед анализом. Эти нежелательные твердые частицы могут быть удалены фильтрацией, чтобы избежать повреждения инструмента.

В некоторых случаях растворенный металл должен быть связан с другим соединением — называемым хелатирующим агентом — чтобы быть обнаруженным.Этот процесс называется хелатированием. Когда нежелательные виды также связываются с хелатирующим агентом, они должны быть замаскированы.

Это делается путем добавления маскирующего агента, который ингибирует хелатирование определенных металлов. Это предотвращает обнаружение нежелательных металлов. Затем можно выполнить демаскирование мешающих соединений, чтобы высвободить ионы металлов и включить их анализ.

Теперь, когда изложены основы подготовки образцов, давайте посмотрим, как это выполняется в лаборатории.

Для начала выберите мерную колбу соответствующего размера.

Замочите мерную колбу и пробку в 1% соляной кислоте, чтобы удалить любые адсорбированные катионы. Снимите колбу и пробку после выдержки в течение ночи.

Затем вымойте мерную колбу и пробку с мылом и деионизированной водой, затем тщательно промойте.

Сушить колбу и пробку в сушильном шкафу до полного высыхания.

Как только колба остынет, взвесьте необходимый образец и добавьте его в колбу.Запишите массу использованного образца.

Добавьте примерно ¾ объема растворителя в колбу, поставьте на место пробку и осторожно встряхните, чтобы растворить твердые вещества.

Добавить остаток растворителя, пока мениск не коснется калибровочной метки на колбе. Закройте колбу и переверните ее несколько раз, чтобы тщательно перемешать.

Для удаления нерастворенных твердых частиц загрузите образец в шприц, поместите шприцевой фильтр на наконечник и нажмите на поршень, чтобы вытолкнуть образец через фильтр.Собранный образец теперь полностью подготовлен и готов к анализу.

Если анализируемый образец представляет собой жидкость, а не твердое вещество, его можно измерить объемно с помощью пипетки. Начиная с чистой мерной колбы и пробки, добавьте соответствующий объем образца в колбу и запишите объем.

Добавьте растворитель и завершите подготовку образца, как это делается для твердых образцов.

Если растворенный образец требует хелатирования и маскирования металла, например, при комплексометрическом анализе кальция в присутствии железа, отрегулируйте образец до подходящего значения рН, добавив основание.

Добавьте цианидный маскирующий агент для защиты железа от хелатирования. Позвольте этому реагировать в течение по крайней мере 10 минут.

Добавьте ЭДТА для хелатирования кальция и перемешайте. Используйте достаточно, чтобы сформировать комплекс 1: 1. Теперь образец готов к определению кальция.

Чтобы использовать тот же образец для анализа железа, демаскируйте железо, добавив формальдегид и перемешайте. Образец теперь готов к анализу железа.

Пробоподготовка является важным этапом практически во всех экспериментах и ​​аналитических методах, используемых химиками.

Промышленный дымовой газ может использоваться в качестве источника углекислого газа для культивирования микроводорослей. Чтобы понять, является ли загрязнение тяжелыми металлами газом проблемой, водоросли, выращенные в этом примере, были проанализированы на содержание тяжелых металлов.

После периода роста водоросли собирали из биореакторной жидкости центрифугированием и высушивали вымораживанием перед началом процесса подготовки образца.

Высушенные водоросли расщепляли, используя тепло, азотную кислоту и перекись водорода, чтобы приготовить гомогенный раствор, подходящий для химического анализа.В этом примере содержание тяжелых металлов в высушенных водорослях анализировали с помощью индуктивно-связанной плазмо-масс-спектрометрии или ICP-MS.

Метод одновременно обнаружил 12 металлов в образце без помех и выявил, что металлические загрязнители из дымового газа попали в биомассу водорослей.

Правильная пробоподготовка также важна при изучении сложных материалов, таких как почва, с помощью атомно-абсорбционной спектроскопии.

В этом эксперименте образец высушенной почвы сначала взвешивали на аналитических весах.Затем его добавляли в пробирку для разложения с 1: 1 водой и концентрированной азотной кислотой с использованием пипетки.

После нескольких стадий расщепления образец фильтровали для удаления любых твердых частиц, затем собирали в мерную колбу. Добавляли дополнительное количество воды для разбавления раствора для анализа.

Липидные полиэфиры составляют структурные компоненты частей клеточных стенок. Чтобы изучить эти химические вещества с помощью ГХ-МС, сначала собирали и взвешивали растительную ткань.

После различных стадий обработки и сушки добавляли смесь 1: 1 толуола и гептана для растворения сухого образца.

Флакон был вставлен в автоматический загрузочный лоток ГХ-МС для анализа.

Вы только что посмотрели введение JoVE в пробоподготовку. Теперь вы должны понимать основы подготовки твердых и жидких образцов для последующего анализа.

Спасибо за просмотр!

Подготовка образца белка для протеомного анализа в …

Аннотация

Leishmania является родом простейших трипаносоматид и является паразитом, ответственным за заболевание лейшманиозом. Эти простейшие регулируют экспрессию генов атипичным образом по сравнению с другими высшими эукариотами. Регуляция экспрессии генов характеризуется преобладанием посттранскрипционных регуляторных механизмов над транскрипционными (Clayton, 2002).Таким образом, протеомный анализ оказался важным инструментом для понимания путей, вовлеченных в инфекционность Leishmania , взаимодействия хозяина с паразитом, лекарственную устойчивость и другие. При использовании сравнительного протеомного анализа между различными линиями клеток-паразитов важно, чтобы эти линии культивировались одинаково, с одинаковой плотностью клеток и фазой роста. Что еще более важно, когда подозревают дефекты клеточного цикла, важно синхронизировать клеточные линии в той же фазе клеточного цикла, чтобы устранить возможные артефакты.Этот протокол описывает подготовку образцов цельного белка для протеомного анализа в Leishmania donovani ( L. donovani ).

Ключевые слова: лейшмания, протеомика, пробоподготовка

Материалы и реагенты

  1. Leishmania donovani ( L. donovani ) паразиты
  2. Глюкоза (Sigma-Aldrich, каталожный номер: G8270)
  3. Гидроксимочевина (Sigma-Aldrich, каталожный номер: H8627)
  4. RPMI-1640 (Life Technologies, каталожный номер: 21875-034)
  5. Фетальная бычья сыворотка, инактивированная теплом (HIFBS) (Life Technologies, номер по каталогу: 10270-106)
  6. Пенициллин / Стрептомицин (Life Technologies, каталожный номер: 15140-122)
  7. Буфер HEPES (Life Technologies, каталожный номер: 15630-056)
  8. Сухой лед
  9. Этанол
  10. E-64 (Sigma-Aldrich, каталожный номер: E3132)
  11. CHAPS (Sigma-Aldrich, каталожный номер: 26680)
  12. ASB-14 (Sigma-Aldrich, каталожный номер: A1346)
  13. DTT (Sigma-Aldrich, каталожный номер: 43815)
  14. Bio-Lyte ® Амфолит 3/10 (Bio-Rad Laboratories, каталожный номер: 163-2094)
  15. Мочевина (Sigma-Aldrich, каталожный номер: U5378)
  16. Тиомочевина (Sigma-Aldrich, каталожный номер: T7875)
  17. Бромфеноловый синий (Bio-Rad Laboratories, каталожный номер: 161-0404)
  18. Фосфатно-солевой буфер (PBS) (см. Рецепты)
  19. Буфер для лизиса (см. Рецепты)
  20. Буфер регидратации (см. Рецепты)
  21. Полностью дополненная среда (см. Рецепты)

Оборудование

  1. Пипетка
  2. Центрифуга
  3. Spiramix

Процедура

  1. Leishmania donovani паразитов в логарифмической фазе (~ 5 × 10 6 паразитов / мл) культивировали в полностью дополненной культуральной среде при 25 ° C и синхронизировали с добавлением 2.5 мМ гидроксимочевина в течение 12 часов.
  2. По истечении этого периода времени паразитов осторожно трижды промывают 10 мл PBS и высвобождают в 10 мл полностью дополненной среды RPMI.
  3. 5 x 10 8 -10 9 паразитов собирают центрифугированием (500 x g , 15 мин, RT).
  4. Паразитарный осадок дважды промывают 10 мл PBS с добавлением 0,1% (мас. / Об.) Глюкозы.
  5. Паразитический осадок ресуспендируют в 50 мкл буфера для лизиса с использованием пипетки.
  6. Лизированные паразиты подвергают пяти циклам замораживания-оттаивания в твердом СО 2 / этанол.
  7. Образец центрифугируют при 20000 × × в течение 30 мин при 4 ° С.
  8. К супернатанту добавляют 400 мкл регидратационного буфера [содержащего 0,2% (об. / Об.) Bio-Lyte ® ].
  9. Образец инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре при слабом вращении.
  10. После окончания инкубации образец центрифугируют при 17000 × × g в течение 40 мин при комнатной температуре.
  11. Супернатант теперь можно использовать для протеомного анализа или хранить при -80 ° C для дальнейшего использования.

Ноты

  1. На всех этапах процедуры требуется особая осторожность, поскольку образец белка не должен быть загрязнен белками окружающей среды ( e.грамм. кератина). Желательно избегать использования голых рук во время процедуры.
  2. После добавления регидратационного буфера образец не должен подвергаться воздействию температур ниже 10 ° C из-за осаждения, опосредованного мочевиной.
  3. Bio-Lyte ® следует добавлять непосредственно перед использованием регидратационного буфера.

Рецепты

  1. PBS
    Растворить
    8 г NaCl
    0.2 г KCl
    1,44 г Na 2 HPO 4
    0,24 г KH 2 PO 4
    В 800 мл дистиллированной H 2 O
    Отрегулируйте рН до 7,4
    Добавить H 2 O к 1 л
    Стерилизован в автоклаве
  2. Буфер для лизиса
    400 мкл Трис-HCl (рН 9,5)
    20 мкл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0)
    100 мкл 1 мМ E-64
    Добавить дистиллированную H 2 O до 10 мл
    Аликвотируют и хранят при -20 ° C
  3. Буфер регидратации
    К объему 3 мл дистиллированной H 2 O растворяют
    4.8 г мочевины
    1,52 г тиомочевины
    0,4 г CHAPS
    0,1 г DTT
    0,24 г ASB-14
    5 мкл 0,1% (вес / объем) бромфенолового синего
    Добавить дистиллированную H 2 O до 10 мл
    Аликвотируют и хранят при -20 ° C
  4. Полностью дополненная среда
    RPMI-1640
    10% (по объему) HIFBS
    10 мм HEPES
    100 ед / мл пенициллин / стрептомицин

Подтверждения

Этот протокол был адаптирован из Clayton (2002) и Smirlis et al. (2006). Частичное финансирование со стороны Генерального секретариата научно-технической акции «Предложения по развитию научно-исследовательских институтов, Krepis» поддержало эту работу.

Ссылки

  1. Alexandratos, A., Clos, J., Samiotaki, M., Efstathiou, A., Panayotou, G., Soteriadou, K. and Smirlis, D. (2013). Потеря вирулентности сверхэкспрессирующих гистон h2 паразитов Leishmania donovani напрямую связана со снижением скорости трансляции HSP83. Mol Microbiol 88 (5): 1015-1031.
  2. Clayton, C.E. (2002). Жизнь без транскрипционного контроля? От мухи к человеку и обратно. EMBO J 21 (8): 1881-1888.
  3. Smirlis, D., Bisti, S.N., Xingi, E., Konidou, G., Thiakaki, M. and Soteriadou, K.P. (2006). Leishmania сверхэкспрессия гистона h2 задерживает развитие клеточного цикла паразита, дифференцировку паразита и снижает инфекционность Leishmania in vivo.Mol Microbiol 60 (6): 1457-1473.

Пожалуйста, войдите или зарегистрируйтесь бесплатно для просмотра полного текста

Посмотреть полный текст

Скачать PDF

Вопрос &

Авторские права: © 2014 Авторы; эксклюзивный лицензиат био-протокола ООО.

Как цитировать: Александрат А. и Смирлис Д. (2014). Подготовка образца белка для протеомного анализа в Leishmania donovani . Био-протокол 4 (5): e1058. DOI: 10.21769 / BioProtoc.1058.

,

Отправить ответ

avatar
  Подписаться  
Уведомление о